白術(shù)多糖對小鼠胸腺與脾臟指數(shù)、組織結(jié)構(gòu)及p38/MAPK信號通路的影響

陳非玥,洪龍勝,李婉雁,梁舒棋,肖詠儀,田允波,許丹寧,曹 楠*

(1.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州 510225； 2.廣東省水禽健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510225)

免疫器官是機(jī)體執(zhí)行免疫功能的主要場所及防御侵害的天然屏障。毒物、細(xì)菌、病毒等可使機(jī)體免疫細(xì)胞增殖受抑制，免疫器官發(fā)育受損，從而影響機(jī)體免疫應(yīng)答能力。在小鼠淋巴結(jié)腫大、中性粒細(xì)胞增生、脾內(nèi)巨噬細(xì)胞增生和浸潤等病理過程中，致病因子常通過作用于MAPKs信號通路來介導(dǎo)相關(guān)的炎癥反應(yīng)[1-2]。據(jù)報道，p38/MAPK受藥物抑制后，可使動物胸腺中早期T細(xì)胞發(fā)育阻滯、胸腺細(xì)胞數(shù)量減少，造成胸腺免疫功能障礙[3-5]，并使脾細(xì)胞凋亡損傷，對機(jī)體產(chǎn)生不良影響[6]。

近年來，中草藥多糖因其低毒性、多靶點(diǎn)、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)得以廣泛應(yīng)用。值得注意的是，多糖通常存在一個發(fā)揮其功效的最適濃度范圍，濃度過高可能會抑制部分免疫細(xì)胞的免疫活性。白術(shù)多糖(polysaccharide ofAtractylodesmacrocephalaKoidz，PAMK)是白術(shù)發(fā)揮其生物功效的主要成分。已有研究表明，白術(shù)多糖及其他補(bǔ)益類中藥多糖可提升機(jī)體免疫器官指數(shù)，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖與分化，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的活性，促進(jìn)細(xì)胞因子生成與分泌，參與抗體和補(bǔ)體的形成，并可激活MAPK/AP-1信號通路誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟[7-9]。因此，研究不同濃度的白術(shù)多糖對動物機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用具有一定理論意義，可為相關(guān)的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 白術(shù)多糖 白術(shù)多糖(PAMK)，多糖含量為95%，西安市天園生物制劑廠產(chǎn)品。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動物 40只4周齡雌性Balb/c小鼠，購于南方醫(yī)科大學(xué)。

1.1.3 主要試劑 40 mg/mL多聚甲醛通用型組織固定液(BL539A)，廣州賽國生物科技有限公司產(chǎn)品；高效切片石蠟，上海華申康復(fù)器材有限公司產(chǎn)品；TRIzol RNA分離試劑(15596026)，美國Ambion公司產(chǎn)品；2×PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix(A25742)，美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Rr036A)，TaKaRa公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要儀器 電子天平(FA1604)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；石蠟包埋機(jī)(EC300)、石蠟切片機(jī)(HM340E)，德國MICROM公司產(chǎn)品；雙目顯微鏡(ECLIPSE E100)，日本Nikon公司產(chǎn)品；超微量紫外分光光度計(Epoch)，美國Bio-Tek公司產(chǎn)品；實(shí)時熒光PCR儀(PRISM 7500)，美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為5組，分別為對照組與4個不同濃度的白術(shù)多糖處理組。其中，處理組給藥劑量為每日100、200、400、600 mg/kg，對照組給予等劑量的生理鹽水，連續(xù)灌胃14 d。飼養(yǎng)環(huán)境均處于同一水平：溫度18 ℃～29 ℃，相對濕度40%～70%，氨濃度≤15 mg/m3，每天定時稱重給藥、更換墊料，并提供充足的飼糧和飲用水。

1.2.2 胸腺與脾臟指數(shù)測定 飼養(yǎng)至第15天時對小鼠進(jìn)行活體稱重，隨后處以安樂死，在無菌環(huán)境下采集胸腺與脾臟，分別稱重，按照以下公式計算胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)。

胸腺指數(shù)=胸腺重量(mg)/體重(g)；

脾臟指數(shù)=脾臟重量(mg)/體重(g)。

1.2.3 胸腺與脾臟組織顯微結(jié)構(gòu)觀察 切取0.5 cm3的組織塊，于40 mg/mL多聚甲醛溶液中固定，制備石蠟切片，具體參照何書海等[10]的方法進(jìn)行。通過正置顯微鏡觀察胸腺與脾臟組織結(jié)構(gòu)，并利用CCD采集圖像。

1.2.4 real-time PCR檢測基因表達(dá)量 使用TRIzol提取胸腺與脾臟組織總RNA，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量、超微量紫外分光光度計測定RNA濃度，再根據(jù)濃度用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，將cDNA保存于-20 ℃冰箱備用。

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫序列，設(shè)計合成相關(guān)引物。引物名稱與序列信息見表1。采用SYBR Green熒光染料法進(jìn)行目的基因表達(dá)檢測，總反應(yīng)體系20 μL，包括 cDNA 1 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，2×PowerUpTMSYBRTMGreen Master Mix 10 μL，dH2O 7 μL。反應(yīng)條件為:50 ℃ 2 min;95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 25 s，共40個循環(huán)。采用2-△△Ct算法計算小鼠胸腺組織與脾臟組織中p38/MAPK信號通路相關(guān)的關(guān)鍵基因ASK1、p38、MSK1/2 mRNA的相對表達(dá)量，以GAPDH作為內(nèi)參基因。

表1 引物序列信息

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Prism 7.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，Tukey多重比較法進(jìn)行組間比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠體重、胸腺與脾臟重、胸腺與脾臟指數(shù)的比較

結(jié)果見表2。由表2可知，相比于對照組，添加100、200、400 mg/kg白術(shù)多糖均可上調(diào)胸腺指數(shù)，而添加200、400、600 mg/kg白術(shù)多糖則可上調(diào)脾臟指數(shù)，且濃度為200 mg/kg時，胸腺與脾臟的重量及器官指數(shù)皆顯著升高(P<0.05)，說明添加200 mg/kg白術(shù)多糖可更好的促進(jìn)免疫器官發(fā)育，并更有利于機(jī)體的新陳代謝。

表2 各組小鼠體重、胸腺與脾臟重、胸腺與脾臟指數(shù)的比較

2.2 不同濃度白術(shù)多糖對小鼠胸腺組織結(jié)構(gòu)的影響

結(jié)果見圖1。由圖1可知，對照組胸腺皮質(zhì)厚度與髓質(zhì)面積適中，皮質(zhì)內(nèi)淋巴細(xì)胞排列整齊，髓質(zhì)內(nèi)散布著胸腺上皮細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)良好，被膜結(jié)構(gòu)完整。與對照組相比，100 mg/kg組胸腺組織結(jié)構(gòu)無明顯變化；200 mg/kg組胸腺組織中皮質(zhì)相對較厚、染色較深，其中富含胸腺細(xì)胞，整體而言細(xì)胞分布排列規(guī)則整齊；而400 mg/kg組和600 mg/kg組的胸腺組織均呈現(xiàn)出皮質(zhì)略薄、染色較淺的狀態(tài)，且400倍鏡下可見600 mg/kg組的細(xì)胞排列稍為疏松。

2.3 不同濃度白術(shù)多糖對小鼠脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

結(jié)果見圖2。由圖2可知，對照組脾臟組織結(jié)構(gòu)正常，白髓與紅髓交叉分布，動脈周圍淋巴鞘輪廓較為明顯，大小適中，淋巴細(xì)胞排列規(guī)整。而相比于對照組，100 mg/kg組的白髓結(jié)構(gòu)正常，動脈周圍淋巴鞘稍有增大，但整體結(jié)構(gòu)無明顯變化；200 mg/kg組的脾臟組織中，動脈周圍淋巴鞘面積增大，淋巴細(xì)胞密集且排列規(guī)則整齊；400 mg/kg組的脾臟組織中，紅髓與白髓的結(jié)構(gòu)及界限清晰，但白髓面積及動脈周圍淋巴鞘大小無明顯變化；600 mg/kg組的脾臟組織中，動脈周圍淋巴鞘面積有所增大，但細(xì)胞排列較為疏松。

A～E.對照組、白術(shù)多糖100、200、400、600 mg/kg組(100×)；a～e.對照組、白術(shù)多糖100、200、400、600 mg/kg組(400×);▲.髓質(zhì)；★.皮質(zhì)

A～E.對照組、白術(shù)多糖100、200、400、600 mg/kg組(100×)；a～e.對照組、白術(shù)多糖100、200、400、600 mg/kg組(400×)；→.動脈周圍淋巴鞘

2.4 不同濃度白術(shù)多糖對小鼠胸腺組織p38/MAPK信號通路相關(guān)關(guān)鍵基因mRNA相對表達(dá)量影響

結(jié)果如圖3所示。200 mg/kg組胸腺組織與脾臟組織內(nèi)關(guān)鍵基因mRNA相對表達(dá)量的上調(diào)趨勢最為明顯。在胸腺組織樣品組，200 mg/kg組ASK1、MSK2 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于其他組別(P<0.05)，p38 mRNA的相對表達(dá)量顯著高于對照組與600 mg/kg組(P<0.05)。此外，600 mg/kg組ASK1、p38、MSK1/2 mRNA的相對表達(dá)量均低于對照組，但差異不顯著(P>0.05)，表明600 mg/kg對p38/MAPK信號通路可能存在負(fù)性調(diào)節(jié)作用。

2.5 不同濃度白術(shù)多糖對小鼠脾臟組織p38/MAPK信號通路相關(guān)關(guān)鍵基因mRNA相對表達(dá)量影響

結(jié)果如圖4所示。相比于對照組，400 mg/kg組ASK1、MSK2 mRNA的相對表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05)，200 mg/kg組p38、MSK1/2 mRNA的上調(diào)趨勢則更為顯著(P<0.05)，說明400 mg/kg對p38/MAPK信號通路有一定程度的正向調(diào)節(jié)作用，但作用效果遠(yuǎn)不及200 mg/kg組明顯。

3 討論

胸腺是T細(xì)胞發(fā)育、分化、成熟的場所。研究表明，小鼠通常在18日齡后胸腺重量就開始下降，主要表現(xiàn)為皮質(zhì)變薄，皮質(zhì)與髓質(zhì)面積比下降、分界逐漸模糊，胸腺小體數(shù)量減少等[11-12]。脾臟是免疫細(xì)胞定居的場所，同時作為血液循環(huán)中重要的過濾器官，可清除血液內(nèi)的病原體、衰亡的血細(xì)胞與免疫復(fù)合物等[13-14]。胸腺和脾臟分別代表動物的中樞免疫器官和外周免疫器官，其組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的完整性與否代表著動物免疫機(jī)能是否健全。相關(guān)病理組織學(xué)研究顯示，蘆薈多糖可使衰老小鼠的胸腺富含淋巴細(xì)胞，皮質(zhì)增厚，皮質(zhì)與髓質(zhì)間界限明晰，細(xì)胞形態(tài)規(guī)整，表明蘆薈多糖可降低小鼠胸腺淋巴細(xì)胞的衰老性減少，發(fā)揮抗衰功效[15]；黃芪多糖可升高小鼠的脾臟重量與脾臟指數(shù)，并使睡眠被剝奪小鼠的動脈周圍淋巴鞘厚度升高至正常水平，表明黃芪多糖可有效改善小鼠的脾組織結(jié)構(gòu)[16]；天門冬多糖可緩解由環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠免疫器官組織結(jié)構(gòu)損傷，使其胸腺內(nèi)皮質(zhì)區(qū)增大、髓質(zhì)區(qū)減小，并顯著提升脾臟指數(shù)[17]；丹參多糖則可上調(diào)免疫功能低下小鼠的胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)，并可使糖尿病小鼠脾臟動脈周圍淋巴鞘變厚，淋巴細(xì)胞排列更為緊密[18-19]。上述研究充分反映了多糖作為免疫增強(qiáng)劑對組織器官的保護(hù)效果。在本研究中，添加了200 mg/kg白術(shù)多糖后，小鼠胸腺重量與胸腺指數(shù)比對照組顯著升高，胸腺皮質(zhì)相對較厚，淋巴細(xì)胞數(shù)量較多，皮質(zhì)與髓質(zhì)間的界限清晰，表明白術(shù)多糖在適宜濃度下可促進(jìn)免疫細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)胸腺的發(fā)育。灌服白術(shù)多糖后，小鼠脾臟重量與脾臟指數(shù)同樣顯著上調(diào)，脾臟組織內(nèi)動脈周圍淋巴鞘相對增厚，淋巴細(xì)胞密集分布，脾臟結(jié)構(gòu)更為完善。此外，100 mg/kg組相比于對照組無明顯變化；而600 mg/kg組的作用效果不佳，其中淋巴細(xì)胞相對較少，細(xì)胞排列較為疏松，可能是因白術(shù)多糖的濃度過高會對組織產(chǎn)生一定的不良影響。這與李鵬等[20]研究獲得的白術(shù)多糖濃度在250 mg/kg～500 mg/kg時可增強(qiáng)小鼠脾臟內(nèi)單核巨噬細(xì)胞的免疫活性的結(jié)果相似。Ren Z等[21]的研究結(jié)果表明，200 mg/kg和400 mg/kg劑量的大葉貫眾多糖對環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，而100 mg/kg的劑量效果不明顯；王向濤等[22]研究則反映，中高劑量的龍葵多糖可明顯提升S180荷瘤小鼠的胸腺與脾臟指數(shù)，但高劑量組荷瘤小鼠的生存時間及抑瘤率不如中低劑量組，其中中劑量組的抑瘤效果最佳。由此可見，多糖在合適的劑量下可更為有效的增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答能力，抵御機(jī)體內(nèi)外環(huán)境中的不良影響。本研究結(jié)果表明，白術(shù)多糖濃度為200 mg/kg時可更好的發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用，提升小鼠的胸腺與脾臟指數(shù)，促進(jìn)胸腺與脾臟結(jié)構(gòu)和功能的完善。

同一基因內(nèi)上標(biāo)小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，小寫字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)

同一基因內(nèi)上標(biāo)小寫字母不同表示組間差異顯著(P<0.05)，小寫字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)

p38是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族成員之一，在細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡和細(xì)胞間功能同步等多種過程中發(fā)揮重要作用[23]。ASK1為p38/MAPK信號通路最上游與調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)的MAPKKK類激酶，可平衡和整合細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)并作出合適應(yīng)答。ASK1受相應(yīng)刺激致磷酸化后可促進(jìn)MKK3/6基因表達(dá)，并促其表達(dá)的蛋白磷酸化從而誘導(dǎo)p38 MAPK基因轉(zhuǎn)錄，活化的p38 MAPK可將MSK1/2磷酸化，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)[24]。有研究者將小鼠脾臟巨噬細(xì)胞用p38/MAPK抑制劑處理后再予以輕度刺激，處理過的巨噬細(xì)胞與未經(jīng)處理的相比較，其吞噬、趨向及殺傷能力大幅減弱，表明脾臟的免疫調(diào)節(jié)能力因p38/MAPK信號通路未能激活而有所下降[25]。還有研究證明，TNF-α與IL-1可激活p38/MAPK并激活胸腺細(xì)胞內(nèi)AP-1、NF-AT及NF-κB的轉(zhuǎn)錄，故p38/MAPK可調(diào)控胸腺細(xì)胞的成熟和分化[26]。此外，Li Q等[27]發(fā)現(xiàn)富硒食用茹多糖可能通過作用于多條MAPK信號通路提升小鼠血清中丙二醛含量及抗氧化酶類的活性。劉晶等[28]也研究發(fā)現(xiàn)，米糠多糖可通過MAPK信號通路緩解由葡聚糖硫酸鈉引起的小鼠結(jié)腸炎，并抑制脾臟水腫和炎癥反應(yīng)。可見，MAPK信號通路在多糖免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。本研究中，200 mg/kg組小鼠的胸腺與脾臟組織中p38/MAPK信號通路相關(guān)的關(guān)鍵基因表達(dá)量均有一定程度的升高，并且該濃度白術(shù)多糖對p38/MAPK級聯(lián)反應(yīng)途徑中處于下端的激酶MSK1/2有較為明顯的正向促進(jìn)作用；而白術(shù)多糖濃度為100 mg/kg時，可能因劑量過低而作用效果不明顯；濃度為600 mg/kg時，則可能因濃度過高對機(jī)體產(chǎn)生負(fù)性調(diào)節(jié)作用。本研究結(jié)果也表明，當(dāng)濃度白術(shù)多糖為200 mg/kg時可更好的激活p38/MAPK信號通路，進(jìn)一步調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)。結(jié)合小鼠的胸腺和脾臟指數(shù)變化以及組織切片觀察結(jié)果，進(jìn)一步說明灌服200 mg/kg白術(shù)多糖，可促進(jìn)小鼠免疫器官中免疫細(xì)胞的增殖，從而提升機(jī)體的免疫機(jī)能。

在200 mg/kg濃度下，白術(shù)多糖作為外來刺激原能激活小鼠胸腺與脾臟組織細(xì)胞的p38/MAPK信號通路，提高相關(guān)基因的表達(dá)量，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖，從而促進(jìn)免疫器官發(fā)育、改善免疫器官的結(jié)構(gòu)與功能，提高機(jī)體的免疫應(yīng)答能力。