幾株益生菌的性能比較研究

謝 曈，呂虹雨，朱佳佳，郝智慧*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052)

在畜禽養(yǎng)殖業(yè)上，抗菌藥物在促進動物生長、預(yù)防疾病和治療疾病中都發(fā)揮著重要作用[1]。但長期使用或濫用抗菌藥物，會使抗菌藥物殘留于肉產(chǎn)品或者糞污之中，并通過食物鏈傳播，最終影響人類的健康[2]?？咕幬锬退幮詥栴}已經(jīng)成為了21世紀人類面臨最大的挑戰(zhàn)[3]。因此，在預(yù)防動物疾病時，減少抗菌藥物的使用，并尋找抗菌藥物代替品越發(fā)重要。而益生菌作為一種能夠抑制病原菌生長、并維持畜禽腸道微生態(tài)的平衡的新型微生物制劑[4]，能夠產(chǎn)生各種酶物，發(fā)揮抗感染作用[5]，并且增強畜禽免疫力、抵御應(yīng)激，還對代謝產(chǎn)物發(fā)揮解毒作用[6]，在獸醫(yī)臨床上，可作為抗菌藥物的良好代替品。但是對于制備出性能較好的益生菌產(chǎn)品，益生菌菌種的性能非常重要，基于此，本試驗以10株益生菌為材料，比較研究其繁殖能力、產(chǎn)酸能力、抑菌能力、耐高溫能力以及在模擬胃液中的存活能力，篩選出具有良好益生作用的候選菌株，為益生菌制劑的制備提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 5株植物乳桿菌IMAU70010(Lab2)、IMAU30151(Lab3)、IMAU80076(Lab4)、IMAU80184(Lab8)、IMAU80002(Lab13)和屎腸球菌S10-4 2009.10.29(S11)，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點實驗室惠贈；屎腸球菌NCIMB 10415(CLC-J)、DSM 7134(BDY-J)、FLC(AY-J)、以及雙歧桿菌ND(MMA-J)購自市場。

1.1.2 主要培養(yǎng)基及配制 MRS肉湯培養(yǎng)基(1 000 mL)：葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，牛肉膏15 g，酵母膏7.5 g，乙酸鈉7.5 g，檸檬酸銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.3 g，pH 6.8。MRS瓊脂培養(yǎng)基(1 000 mL)：葡萄糖20 g，蛋白胨15 g，牛肉膏15 g，酵母膏7.5 g，乙酸鈉7.5 g，檸檬酸銨2 g，磷酸氫二鉀2 g，硫酸鎂0.3 g，瓊脂15 g，pH 6.8。LB肉湯培養(yǎng)基(1 000 mL)：NaCl 10 g，蛋白胨10 g，酵母膏5 g。

1.1.3 其他試劑 模擬胃液的配制：取2.0 g氯化鈉和3.2 g胃蛋白酶(標識應(yīng)為800 U/mg～2 500 U/mg)，加7.0 mL鹽酸和水使溶解至1 000 mL，該溶液pH應(yīng)為1.2。

1.1.4 主要儀器及設(shè)備 pH計，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司產(chǎn)品；紫外分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；水浴鍋，常州國華電器有限公司產(chǎn)品；恒溫振蕩器，上海福瑪實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化、純化及保藏 從-80 ℃冰箱中取出凍存的菌株，待自然溶化后，取10 mL凍存菌液于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃、160 r/min搖床培養(yǎng)活化。

1.2.2 菌株的生長能力和產(chǎn)酸能力測定 取10 mL已純化的試驗菌液于100 mL的MRS肉湯中，37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)，分別在0、3、6、8.5、12、14、17、20、24 h取樣，對其產(chǎn)酸能力和菌體生長繁殖能力進行評價。產(chǎn)酸能力測定：取培養(yǎng)液20 mL，8 000 r/min離心15 min，除去菌體，用pH計測定培養(yǎng)液的pH。生長繁殖能力測定：取培養(yǎng)液10 mL，用紫外分光光度計進行測定，以空白培養(yǎng)基為對照，測定培養(yǎng)液的OD值。

1.2.3 菌株抑制大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的試驗 將大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌接種到LB肉湯中進行培養(yǎng)，分別在37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)18 h獲得菌懸液。取100 μL大腸埃希氏菌菌懸液接種于MRS瓊脂培養(yǎng)基，用涂布棒涂布均勻后，在培養(yǎng)皿內(nèi)等距放入4個牛津杯，靜置一會，再取200 μL乳酸菌菌懸液加入到牛津杯中，靜置10 min。于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察培養(yǎng)皿中牛津杯周圍是否有抑菌圈出現(xiàn)，并采用游標卡尺測定抑菌圈的直徑。

1.2.4 菌株在模擬胃液條件下的存活率試驗 菌株活化后，在MRS肉湯中，37 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)至渾濁，取0.5 mL菌懸液加入到4.5 mL模擬胃液中進行培養(yǎng)，以正常培養(yǎng)條件為對照，并分別于0、10、20、30、60 min采用平板計數(shù)法進行活菌計數(shù)。

1.2.5 菌株在不同高溫條件中的試驗 取已純化的菌株10 mL，于100 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，以常溫下培養(yǎng)為對照，然后分別在40、45、50、55、60、65 ℃水浴下，振蕩培養(yǎng)1 h，采用平板計數(shù)法對不同溫度條件下的培養(yǎng)的菌株進行活菌計數(shù)，比較各菌株在不同高溫環(huán)境下的存活能力。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 采用EXCEL進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，運用GraphPad 5進行作圖分析。數(shù)據(jù)通過SPSS進行顯著性分析，并進行LSD與Duncan′ s 多重比較，以P<0.05和P<0.01差異顯著為顯著性和極顯著性判斷標準，數(shù)據(jù)結(jié)果以平均值±標準差表示；其中活菌數(shù)只以平均值進行表示。

2 結(jié)果

2.1 菌株的生長能力和產(chǎn)酸能力試驗結(jié)果

菌株的生長能力和產(chǎn)酸能力是判斷菌株活性的指標，結(jié)果如圖1所示。4種市售的益生菌(3種屎腸球菌和1種雙歧桿菌)的菌株生長能力相對較優(yōu)，且CLC-J>AY-J>BDY-J>MMA-J，S11生長能力最弱(OD值小于2)，其余5種植物乳桿菌菌株生長能力居中(OD值的范圍)。菌株的pH曲線(圖1B)反映10株菌株的產(chǎn)酸效果，5株植物乳桿菌的產(chǎn)酸效果差異不大，pH在8.5 h后均到達了4以下，S11培養(yǎng)24 h后，pH變化微小，而4種產(chǎn)品的pH在24 h后均達到5左右。

圖1 10株菌株在不同時間下的生長變化和pH

2.2 10株菌株對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制試驗結(jié)果

本研究選擇2種動物腸道中主要的病原菌大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌作為致病菌，篩選出對這2種致病菌有抑制效果的乳酸菌菌株。在大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的活菌為1×108CFU/mL時，乳酸菌對兩者的抑制效果見表1。CLC-J和BDY-J對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，分別達到了24.21 mm±0.12 mm、22.16 mm±0.21 mm和25.09 mm±0.03 mm、23.19 mm±0.23 mm，Lab8和Lab13對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈達到24.16 mm±0.33 mm、24.31 mm±0.24 mm和23.26 mm±0.16 mm、23.08 mm±0.05 mm， AY-J和Lab2、Lab3、Lab4的抑菌效果次之，抑菌效果較差的為MMA-J和S11。整體來看，各菌株對金黃色葡萄球菌的抑制效果較大腸埃希氏菌好。

表1 10株菌株對金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌的抑菌效果

2.3 菌株在模擬胃液條件下的存活率試驗結(jié)果

通過菌株在模擬胃液條件下的存活試驗，以獲得可以在胃中穩(wěn)定存活的菌株。比較不同時間點菌株的耐酸效果，得出不同的菌株耐酸性隨著時間的變化情況(表2)。隨著時間的推移，所有菌株在模擬胃液中的菌落數(shù)都有不同程度的降低。其中以BDY-J在60 min后的活菌數(shù)達到8.45×104CFU/mL，S11號在20 min后活菌數(shù)已減少到112 CFU/mL；在酸處理10 min后，CLC-J、BDY-J和Lab13菌株活菌數(shù)均在107CFU/mL以上，從整體來看，所有的菌株在模擬胃液條件下的活菌數(shù)菌顯著下降，耐酸效果均不理想。

表2 10株菌株在模擬胃液中不同時間處理的耐受效果

2.4 菌株在不同溫度條件中的試驗結(jié)果

10株菌株在不同溫度下水浴處理1 h后,在40 ℃左右菌株均可以正常生長，高于40 ℃，各菌株活菌數(shù)均開始減少，BDY-J在高于50 ℃時，活菌數(shù)仍可達到3.68×106CFU/mL、CLC-J的活菌數(shù)達到2.31×106CFU/mL、AY-J的活菌數(shù)達2.52×106CFU/mL。Lab13菌株耐50 ℃高溫的活菌數(shù)達1.5×106CFU/mL(表3)。

表3 不同溫度下10株菌株的耐高溫結(jié)果

3 討論

外源益生菌定植腸道需要耐受胃腸道中的pH環(huán)境及消化酶[7]的影響，且益生菌容易受到外界環(huán)境的影響，如保存過程中活菌數(shù)下降導(dǎo)致到達腸道有效部位的菌群數(shù)降低，無法發(fā)揮益生菌的益生作用。因此，益生菌制劑的制作對益生菌提高抗逆性、充分發(fā)揮益生作用具有重要影響[8]，而理想的制備益生菌制劑的菌株應(yīng)具有穩(wěn)定的繁殖和產(chǎn)酸能力、在消化道目標位置存活、產(chǎn)生抗菌物質(zhì)、與病原菌拮抗起到抑菌效果，且在制劑制作過程中能具有穩(wěn)定性。

菌株的生長能力和產(chǎn)酸能力是判斷菌株活性的指標。菌株生長能力是用于判斷菌株到達腸道之后快速繁殖的能力，菌株的生長繁殖能力越強，在到達腸道后，繁殖越具有優(yōu)勢。益生菌的活菌期短，是其很大的一個問題[9]。本試驗發(fā)現(xiàn)，10株益生菌均能在培養(yǎng)基中穩(wěn)定生長，說明其生長能力較好。

益生菌產(chǎn)生的有機酸是其發(fā)揮益生作用的重要機制之一，近年來越來越受到重視[10]，且許多益生菌是靠有機酸的生成來發(fā)揮阻礙致病菌生長作用的[11]。研究發(fā)現(xiàn)[12]，發(fā)酵乳桿菌后最終的菌液pH值在4.3左右，發(fā)酵乳桿菌YPH·1-3-3最終pH為4.1[13]。本研究發(fā)現(xiàn)的5株植物乳桿菌(lab2、lab3、lab4、lab8、lab13)的pH在24 h內(nèi)均小于4，說明其產(chǎn)酸能力具有部分優(yōu)勢。

此外，菌株的抑菌能力是益生菌篩選的重要指標[14]。金黃色葡萄球菌和大腸埃希氏菌是腸道常見的致病菌，本試驗發(fā)現(xiàn)各菌株對2種致病菌的抑制作用都良好，金黃色葡萄球菌的抑制效果均好于大腸埃希氏菌，BDY-J、Lab8、Lab13對大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制效果最好。有研究篩選出的糞腸球菌對大腸埃希菌也能產(chǎn)生抑制效果，最大抑菌圈直徑達18.33 mm[15]，而本試驗選出的幾種益生菌的抑菌效果更好。而對于金黃色葡萄球菌，有研究篩選出的植物乳桿菌也能對金黃色葡萄球菌產(chǎn)生抑制效果，抑菌圈直徑為13.33 mm±0.29 mm[16]，而本試驗的益生菌產(chǎn)生抑菌效果也更佳。

動物的胃腸道環(huán)境較為復(fù)雜，胃液的酸性環(huán)境會對益生菌的存活產(chǎn)生影響，因此，菌株的耐酸性也是評價乳酸菌的一個重要指標[17]。本試驗發(fā)現(xiàn)，在pH 1.2的模擬胃液環(huán)境下，活菌數(shù)下降較快，在10 min后，Lab13菌株活菌數(shù)最大，而后CLC-J、BDY-J菌株的活菌數(shù)也均在107CFU/mL以上，60 min后，10株益生菌在胃液的酸性環(huán)境的存活能力都較為不佳，只有BDY-J的活菌數(shù)達到8.45×104CFU/mL。另有研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌KLDS1.0318在pH 1.5條件下活菌數(shù)下降較快,培養(yǎng)至3 h其活菌數(shù)對數(shù)值降為零[18]。

植物乳桿菌的適宜溫度為中溫[19]，益生菌的高溫耐受性的研究相對較少，而一般認為在30 ℃到40 ℃左右為最合適的生長溫度。菌株的耐高溫能力的比較反映的是菌種在后期儲存、加工過程中的穩(wěn)定性。有研究表明，屎腸球菌的最低生長溫度為4.8 ℃,最高生長溫度為54.6 ℃,最適生長溫度為41 ℃[20]。本試驗發(fā)現(xiàn)在40 ℃左右菌株均可以正常生長，高于40 ℃則各菌株活菌數(shù)均開始減少，其中BDY-J在高于50 ℃時，活菌數(shù)仍可達到3.68×106CFU/mL，Lab13菌株耐50 ℃高溫的活菌數(shù)達1.5×106CFU/mL。通過耐高溫試驗結(jié)果說明，益生菌在超過一定溫度的環(huán)境中，生長受到限制，繁殖能力被破壞，使得活菌數(shù)下降，而BDY-J和Lab13號菌株在溫度較高時的耐熱能力比其他菌株更強。