RNA干擾AC-cathB-1基因?qū)V州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲發(fā)育的影響

王兵麗，劉琪龍

(1.閩南師范大學生物科學與技術(shù)學院，福建漳州 363000；2.廈門大學生命科學學院，福建廈門 361005)

廣州管圓線蟲(Angiostrongyluscantonensis)入侵軟體動物作為其中間宿主，人因食入含有廣州管圓線蟲幼蟲的中間宿主而感染。廣州管圓線蟲病主要侵犯人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)，以嗜酸性粒細胞增多性腦膜炎為主要特征。近年來，隨著人們飲食習慣的多樣性和水陸交通的發(fā)展，廣州管圓線蟲病的流行呈上升趨勢，有些地區(qū)甚至暴發(fā)流行，引起相關(guān)專家和學者的重視[1-3]。 然而，目前仍無有效的手段對廣州管圓線蟲病進行診斷和治療。因此，對其深入研究很有必要。半胱氨酸蛋白酶是蛋白酶家族中的重要成員，廣泛分布于哺乳類、魚類和寄生蟲等很多生物體內(nèi)[4-6]，是一類功能多樣的蛋白水解酶。除了其蛋白水解活性外，由于該蛋白水解酶在寄生蟲入侵宿主、營養(yǎng)攝取、水解宿主細胞內(nèi)蛋白、蛻皮、免疫逃避等過程中發(fā)揮著不可替代的作用，與多種重要動植物疾病密切相關(guān)，是近年來備受關(guān)注的一類靶標蛋白酶[7-10]。但對于涉及其中的分子機制，特別是關(guān)鍵基因還不甚了解。廣州管圓線蟲的寄生宿主及其生活史和其他寄生蟲差異較大，致使其分子機制目前研究進展緩慢。Ni F等[11]已克隆出3種廣州管圓線蟲半胱氨酸蛋白酶家族基因，分別是組織蛋白酶B樣基因1(cathepsin B-like enzyme gene 1，AC-cathB-1)、組織蛋白酶B樣基因2(cathepsin B-like enzyme gene 2，AC-cathB-2)和血紅蛋白酶型半胱氨酸蛋白酶基因(hemoglobin-type cysteine protease gene，hem)。Ni F等[11]和余長茂[12]研究發(fā)現(xiàn)，AC-cathB-1基因的表達量在Ⅰ期幼蟲中較高。廣州管圓線蟲的Ⅰ期幼蟲通過被吞食或主動鉆入福壽螺等中間宿主的體內(nèi)而感染中間宿主，推測AC-cathB-1基因可能在廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲入侵中間宿主的過程中發(fā)揮著必不可少的作用。本研究通過RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)抑制廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲的AC-cathB-1基因，觀察AC-cathB-1基因被抑制后對廣州管圓線蟲入侵中間宿主的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 廣州管圓線蟲，廈門大學寄生動物學實驗室保種；SPF級成年雌性SD大鼠，130 g～ 210 g，廈門大學實驗動物中心提供，動物生產(chǎn)許可證SCXK(閩)2004-0001；福壽螺系廈門大學寄生動物學實驗室繁殖的子代福壽螺。

1.1.2 主要試劑 膠回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；Taq酶、cDNA合成試劑盒、DNA標志物、T4 DNA連接酶和限制性內(nèi)切酶，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；動物組織總RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；蛋白酶K、β-巰基乙醇、熒光定量試劑盒，瑞士Roche公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 熒光定量PCR儀(Q160 plus)，ABI公司產(chǎn)品；PCR儀(QX200)，伯樂公司產(chǎn)品；臺式高速冷凍離心機(TGL-20M)，湖南湘儀公司產(chǎn)品；微量分光光度計(NanoDrop 2000c)，Thermo Scientific公司產(chǎn)品；高壓滅菌鍋(GF88DX)，美國致微公司產(chǎn)品；生物顯微鏡(CX31RTSF)，Leica公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計及dsRNA合成 參照GenBank中廣州管圓線蟲AC-cathB-1基因cDNA的序列和擬南芥Rubisco基因序列，利用Oligo 6軟件設計擴增AC-cathB-1和Rubisco基因的特異性引物CathB1和Rubisco1。以廣州管圓線蟲的β-Actin基因作為內(nèi)參基因。設計用于real-time PCR檢測AC-cathB-1和Rubisco基因的特異性引物CathB2和Rubisco2，以及內(nèi)參基因β-Actin的引物(表1)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 dsRNA合成與real-time PCR檢測的引物序列

1.2.2 廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲的收集 收集廣州管圓線蟲陽性SD大鼠的新鮮糞便，加入生理鹽水充分調(diào)勻。取大鼠糞便液，2 500 r/min離心10 min，棄上清，室溫過夜收集液體，過500目篩網(wǎng)，蒸餾水沖洗篩網(wǎng)，收集篩網(wǎng)上的Ⅰ期幼蟲至離心管中。生理鹽水潤洗之后2 500 r/min離心10 min，重復3次，收集置冰箱備用。

1.2.3 目的片段的擴增與合成dsRNA 用β-巰基乙醇法，按RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的操作，提取廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲的總RNA。根據(jù)cDNA試劑盒說明書的操作步驟，將廣州管圓線蟲RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以合成的cDNA為模板進行PCR擴增，反應條件為：94 ℃預變性3 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸8 min。按照切膠回收試劑盒使用說明書，對目標片段進行切膠回收，并克隆于pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化入大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)DH5α感受態(tài)細菌中，置于LB平板過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆送Invitrogen公司測序。擬南芥Rubisco的目的片段也按同樣的方法制備，產(chǎn)物經(jīng)測序驗證后確定是目的片段。

以目的片段的PCR產(chǎn)物為模板，按照InvitroTranscription T7 Kit試劑盒使用說明書催化合成dsRNA。紫外分光光度計測定260 nm處的吸光值，計算產(chǎn)物濃度，將合成好的dsRNA置于-20 ℃保存。

1.2.4 RNA干擾AC-cathB-1基因?qū)V州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲的影響 將獲得的廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲經(jīng)2 000 r/min離心5 min，沉淀重懸于2 mL的蒸餾水，每組取樣5次(10 μL/次)，顯微鏡下計數(shù)Ⅰ期幼蟲的數(shù)量。用3 mg/mL的AC-cathB-1-dsRNA、Rubisco-dsRNA和生理鹽水分別浸泡Ⅰ期幼蟲，置于搖床25 ℃、80 r/min緩慢搖20 h。

取福壽螺90只，隨機分成3組，每組30只。將AC-cathB-1干擾組、Rubisco干擾組、生理鹽水對照組的廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲(各2 000只)分別侵染各組的福壽螺。感染后3周，鏡檢福壽螺肺組織中的幼蟲結(jié)節(jié)，并確定螺的感染率、死亡數(shù)。將福壽螺壓碎去殼，加消化液，置于37 ℃消化液中消化3 h，過濾后取沉淀物[13]。顯微鏡下計數(shù)Ⅲ期幼蟲數(shù)量、測量蟲體長度，并記錄幼蟲的活力(“+++”表示蟲體活躍，擺動呈緩慢S型，體態(tài)柔和，顏色呈無色透明狀；“++”表示活動力略差，蟲體略僵硬，顏色呈透明至半透明狀；“+”表示蟲體僅頭部或者尾端活動輕微，蟲體僵硬，常靜止呈“C”狀，顏色呈白色)。

1.2.5 Ⅰ期幼蟲AC-cathB-1基因干擾后基因表達量的測定 提取試驗各組的Ⅰ期幼蟲RNA，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，進行real-time PCR反應。反應條件為：95 ℃預變性90 s；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，70 ℃ 15 s，共39個循環(huán)；78 ℃熒光采集10 s。用△Ct計算目的基因的相對表達量，2-△△Ct比較不同組間的基因表達情況。

2 結(jié)果

2.1 Ⅰ期幼蟲AC-cathB-1基因的克隆及dsRNA的合成

用特異性引物對廣州管圓線蟲的cDNA進行擴增AC-cathB-1基因片段，片段大小約為1 100 bp；用特異性引物對擬南芥的cDNA進行擴增，得到片段大小約為500 bp的擬南芥Rubisco大亞基片段。均與預期大小相符。將PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠分離純化，用膠回收試劑盒將AC-cathB-1片段和Rubisco片段進行回收,純化作為模板合成dsRNA(圖1)。

2.2 real-time PCR檢測基因表達情況

通過real-time PCR檢測AC-cathB-1基因表達的結(jié)果顯示，AC-cathB-1干擾組、Rubisco干擾組、生理鹽水對照組的基因相對表達量分別為10.9±1.1、62.1±3.1和75.0±4.5(圖2)。AC-cathB-1干擾組的基因表達量顯著下調(diào)，與Rubisco干擾組和生理鹽水對照組的差異顯著(P<0.05)。

M.DNA 標準DL 1 500;1.Rubisco基因; 2.Rubisco-dsRNA; 3.AC-cathB-1基因; 4.AC-cathB-1-dsRNA

圖2 RNAi后AC-cathB-1基因的相對表達量

2.3 RNA干擾對Ⅲ期幼蟲發(fā)育的影響

2.3.1 福壽螺感染率及幼蟲活力 感染后3周，AC-cathB-1干擾組、Rubisco干擾組和生理鹽水對照組的感染率依次為83.33%、93.33%和100%，各組螺的死亡率分別為3.33%、20%和16.67%(表2)。AC-cathB-1干擾組的幼蟲大部分活動力略差，蟲體略僵硬，顏色透明，Rubisco干擾組、生理鹽水對照組蟲體活躍，擺動呈緩慢S型，體態(tài)柔和，無色透明。

表2 福壽螺感染率、死亡率及幼蟲活力

2.3.2 感染螺體內(nèi)的幼蟲數(shù)量AC-cathB-1干擾組、Rubisco干擾組和生理鹽水對照組的Ⅲ期幼蟲數(shù)量分別為21.2條±1.9條、32.6條±2.6條和36.3條±2.2條。AC-cathB-1干擾組與Rubisco干擾組和生理鹽水對照組之間的差異顯著(P<0.05)(圖3)。

圖3 RNAi對幼蟲數(shù)量的影響

2.3.3 Ⅲ期幼蟲體長 Ⅰ期幼蟲感染中間宿主3周后經(jīng)蛻皮發(fā)育為Ⅲ期幼蟲。經(jīng)測量AC-cathB-1干擾組、Rubisco干擾組、生理鹽水對照組的Ⅲ期幼蟲的長度分別為(471.3±11.8)μm×(25.5±1.1)μm、(475.3±14.3)μm×(25.4±1.3)μm、(476.31±11.5)μm×(25.7±2.0)μm(圖4)。RNA干擾后，Ⅲ期幼蟲體長有所減短，但差異不顯著(P>0.05)。

圖4 RNAi對幼蟲體長的影響

3 討論

半胱氨酸蛋白酶廣泛分布在不同生物體內(nèi)，是一類功能多樣的蛋白水解酶。線蟲的半胱氨酸蛋白酶在其體內(nèi)行使水解的功能，是線蟲的主要“消化酶”，主要存在于蟲體的食道腺和腸細胞中[9]。除其蛋白水解活性外，已有大量報道證明半胱氨酸蛋白酶在寄生蟲的不同發(fā)育階段、對宿主的免疫、營養(yǎng)攝取等方面具有關(guān)鍵作用。瘧原蟲的半胱氨酸蛋白酶可催化降解宿主紅細胞內(nèi)的血紅蛋白[14]；肝片吸蟲(Fasciolahepatica)的半胱氨酸蛋白酶能裂解宿主的免疫球蛋白[15]；棘阿米巴(Acanthamoebacastellanii)的半胱氨酸蛋白酶能夠抑制其早期的成囊過程[16]；RNA干擾秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的半胱氨酸蛋白酶后，可致死95%的胚，說明半胱氨酸蛋白酶是其發(fā)育過程中的關(guān)鍵因子[17]；半胱氨酸蛋白酶的寡肽B幫助利什曼原蟲(Leishmaniaspp.)參與對宿主的免疫逃避過程[18]。

AC-cathB-1基因是廣州管圓線蟲半胱氨酸蛋白酶家族基因之一，Ni F等[11]證明廣州管圓線蟲的AC-cathB-1基因的表達量在Ⅰ期幼蟲中較高；余長茂[12]通過免疫熒光定位證實AC-cathB-1從Ⅰ期幼蟲發(fā)育至成蟲的過程中都集中而且大量的分布于蟲體的消化系統(tǒng)中,推測AC-cathB-1在廣州管圓線蟲中可能起降解宿主紅細胞，與腸上皮細胞間發(fā)生相互作用，并參與食物泡形成等營養(yǎng)攝取的功能。本研究通過RNA干擾技術(shù)干擾廣州管圓線蟲Ⅰ期幼蟲的AC-cathB-1基因，發(fā)現(xiàn)AC-cathB-1基因下調(diào)表達后，Ⅰ期幼蟲在中間宿主福壽螺體內(nèi)的發(fā)育受到一定程度的抑制，感染中間宿主福壽螺后，福壽螺的感染率、死亡率均下降、Ⅲ期幼蟲的數(shù)量及活力也降低。推測這可能是由于AC-cathB-1基因被干擾后影響了幼蟲與宿主腸上皮細胞間的相互作用，減弱了幼蟲的營養(yǎng)攝取功能，進而增加了幼蟲的死亡率，導致Ⅰ期幼蟲發(fā)育成Ⅲ期幼蟲的數(shù)量及活力下降，進一步減弱了對中間宿主福壽螺的致病力。研究結(jié)果表明，AC-cathB-1基因與Ⅰ期幼蟲入侵中間宿主福壽螺體內(nèi)的發(fā)育過程密切相關(guān)，該結(jié)果為揭示AC-cathB-1基因的功能提供了理論基礎，為廣州管圓線蟲病的防治和了解廣州管圓線蟲與中間宿主的相互作用關(guān)系提供了一種靶標和思路，對深入研究廣州管圓線蟲的基因結(jié)構(gòu)與功能具有重要意義。然而，關(guān)于AC-cathB-1基因?qū)τ紫x入侵過程的具體調(diào)控機制還不清楚，有待進一步深入研究。