鮑曼不動桿菌的調(diào)控性非編碼RNA與抗菌藥物耐藥

彭 勤，凌保東

(1. 成都醫(yī)學院結(jié)構(gòu)特異性小分子藥物研究四川省高校重點實驗室，四川 成都 610500； 2. 成都醫(yī)學院藥學院，四川 成都 610500； 3. 南充市中心醫(yī)院藥學部，四川 南充 637000)

鮑曼不動桿菌(Acinetobacterbaumannii)是醫(yī)院感染中常見的革蘭陰性條件致病菌，是全球6大超級細菌-ESKAPE(Enterococcusfaecium、Staphy-lococcusaureus、Klebsiellapneumoniae、Acinetobacterbaumannii、Pseudomonasaeruginosa、Entero-bacterspecies)的成員之一[1-2]。近年來，隨著抗菌藥物的廣泛使用，鮑曼不動桿菌的耐藥率不斷上升，出現(xiàn)多重耐藥、泛耐藥，甚至是全耐藥。2017年世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布首份抗生素耐藥“重點病原體”清單，列出了對人類健康構(gòu)成最大威脅的急需開發(fā)新抗生素的12種重點耐藥細菌，耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌是其中之首，它的出現(xiàn)給抗感染治療帶來重重困難[3-5]。鮑曼不動桿菌的耐藥機制主要包括藥物滅活酶的產(chǎn)生、藥物外排泵的表達、藥物作用靶點改變、生物被膜的形成等[6-8]。近年研究發(fā)現(xiàn)，細菌在抗菌藥物等外界環(huán)境壓力下，會產(chǎn)生特異的調(diào)控性非編碼RNAs(ncRNAs)，在伴侶蛋白Hfq的作用下，與靶基因的mRNA互補配對或通過其構(gòu)像的變化調(diào)控相關(guān)耐藥基因(藥物外排泵、生物被膜形成、毒力因子、細胞膜通透性、細胞壁的合成)的表達水平，從而幫助細菌適應外界環(huán)境壓力[8-11]。此文針對鮑曼不動桿菌的調(diào)控性ncRNAs對耐藥性的調(diào)控作用，以及其作為藥物靶點的研究進展進行綜述。

1 調(diào)控性ncRNAs的分類及作用機制

細菌調(diào)控性ncRNAs是一類廣泛存在于原核生物基因組中能被轉(zhuǎn)錄但不編碼蛋白質(zhì)的長度為50～300nt的RNA分子。細菌ncRNAs主要位于基因間區(qū)，某些還可位于編碼基因的5’端非翻譯區(qū)(5’UTR)和3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)，能折疊成穩(wěn)定的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，與靶基因的mRNA互補或直接與靶蛋白結(jié)合,導致mRNA或蛋白的功能衰減或喪失。根據(jù)調(diào)控ncRNAs的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控方式不同，本文將其分為3類即小RNAs(sRNAs)、5’UTR或3’UTR調(diào)控元件、成簇規(guī)律間隔短回文重復序列(CRISPR)[12-14]。

sRNAs多數(shù)位于基因間隔區(qū)，自身擁有獨立轉(zhuǎn)錄的啟動子和終止子，轉(zhuǎn)錄開始于一段能折疊成穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，終止于 Rho 不依賴的轉(zhuǎn)錄終止子，以順式或反式作用調(diào)節(jié)靶基因的表達[15-17]。靶基因的5’UTR 或者3’UTR調(diào)控元件，以順式作用調(diào)控靶基因的表達[18]，核糖體?？繖C制以及核糖開關(guān)通過靶基因的5’UTR或者3’UTR的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)構(gòu)像改變使核糖體結(jié)合位點和起始密碼子暴露或隱藏，從而調(diào)控細菌對抗生素的敏感性[19-22]。CRISPR序列由眾多短而保守且含有回文序列的重復序列區(qū)(repeat，轉(zhuǎn)錄后可以形成具有穩(wěn)定發(fā)卡結(jié)構(gòu)的tracRNA)和間隔區(qū)(spacer，被細菌俘獲的部分外源DNA序列，轉(zhuǎn)錄后可形成成熟的crRNA)組成。當這些外源遺傳物質(zhì)再次入侵時，crRNA、tracRNA形成sgRNA復合體，與外源遺傳物質(zhì)互補配對并引導cas剪切蛋白破壞外源遺傳物質(zhì)[23-24]。ncRNAs不需要翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮作用，作用速度比蛋白產(chǎn)生速度快，能更快地調(diào)節(jié)諸如群體感應、生物被膜、毒力因子、藥物外排泵等相關(guān)耐藥基因的表達[25]，是細菌對抗菌藥物產(chǎn)生耐藥的重要參與者，因此調(diào)控性ncRNAs有希望成為對抗細菌耐藥的新靶點。

2 調(diào)控性ncRNAs對鮑曼不動桿菌耐藥性及毒力的調(diào)控作用

2.1 調(diào)控性sRNAs對鮑曼不動桿菌生物被膜形成和黏附能力的調(diào)控作用 生物被膜是鮑曼不動桿菌對抗菌藥物高度耐藥的重要原因，也是其重要的毒力因子，而調(diào)控性sRNAs可以通過調(diào)控細菌生物被膜的形成從而影響細菌耐藥性和毒力。付竹青[26]研究發(fā)現(xiàn)，在鮑曼不動桿菌17978中AbsR25和AbsR28的缺失不僅能抑制其對細胞的黏附，還能顯著減少細菌生物被膜的形成以及提高大蠟螟的存活率。研究者發(fā)現(xiàn)，在鮑曼不動桿菌17978中有9個sRNAs只在生物被膜狀態(tài)下高表達，而其中sRNA13573的高表達又可增強鮑曼不動桿菌生物被膜形成的能力和對人肺上皮細胞A549的黏附能力[27]。在鮑曼不動桿菌中，sRNAs作用于靶基因時，常需要分子伴侶Hfq的協(xié)助，以加快sRNAs與靶mRNA二聚體的形成，Kuo等[28]證明，鮑曼不動桿菌17978在Hfq缺失的情況下生物被膜形成量減少，對細胞的黏附能力也減弱，而且參與生物被膜形成的相關(guān)基因，如外膜蛋白ompA、菌毛合成系統(tǒng)csuA/B基因的表達水平也顯著下調(diào)。

2.2 調(diào)控性sRNAs和5’UTR調(diào)控元件對鮑曼不動桿菌外排泵的調(diào)控作用 鮑曼不動桿菌中的藥物外排泵種類多而且底物廣，其高表達是細菌耐藥重要機制之一。研究[29]發(fā)現(xiàn)，AbsR25的靶基因是外排泵主要易化家族(MFS)中的一種新型的磷霉素外排泵基因abaF，在不同亞抑菌濃度的磷霉素條件下AbsR25負調(diào)控abaF基因的表達。在雙組份調(diào)控體adeRS與adeABC外排泵操縱子中，adeR與adeA基因之間存在基因間區(qū)，而且Marchand等[30]研究顯示，adeR與adeA基因間區(qū)存在adeA 5’UTR元件。Wen等[31]研究證實，AdeR蛋白與該基因間區(qū)中的一對10 bp直接重復序列結(jié)合，從而調(diào)控adeABC的表達，提示adeR 5’UTR元件在調(diào)節(jié)adeABC的表達中起著關(guān)鍵作用。

2.3 5’UTR調(diào)控元件對鮑曼不動桿菌耐藥酶的調(diào)控作用 在氯霉素的誘導下，氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶cat基因mRNA的5’UTR調(diào)控元件通過核糖體?？繖C制使其二級結(jié)構(gòu)改變，導致mRNA的核糖體結(jié)合位點和起始密碼子暴露，使下游cat基因高表達，從而使細菌對氯霉素產(chǎn)生抗性。aac/aad氨基糖苷類抗生素核糖開關(guān)在氨基糖苷類抗生素的誘導下，aac/aad基因mRNA的5’UTR調(diào)控元件的二級結(jié)構(gòu)改變，導致mRNA的核糖體結(jié)合位點和起始密碼子暴露，使下游aac/aad基因高表達，介導氨基糖苷類抗生素核糖耐藥[21-22]。

2.5 CRISPR抵抗外源耐藥基因?qū)︴U曼不動桿菌的入侵 CRISPR的間隔序列包含了部分耐藥基因序列，可作為防御外源核酸侵襲的特定“武器”[34]。付恒霞等[35]研究62株臨床耐藥鮑曼不動桿菌，無CRISPR系統(tǒng)的菌株中β-內(nèi)酰胺酶、乙酰轉(zhuǎn)移酶、核苷酸轉(zhuǎn)移酶及16sRNA 甲基化酶等耐藥基因的攜帶率均高于有CRISPR系統(tǒng)菌株，表明CRISPR一定程度上可以抵御外源耐藥對細菌的入侵。

3 靶向調(diào)控性ncRNAs的抗感染策略

3.1 Hfq靶點 在調(diào)控性sRNAs參與的細菌耐藥網(wǎng)絡(luò)中，Hfq發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，Hfq與sRNA結(jié)合后可避免sRNA被核糖核酸酶降解，有助于sRNA的穩(wěn)定，同時促進sRNA-mRNA結(jié)合生成環(huán)狀蛋白質(zhì)復合物[36-37]。此外，Hfq作為鮑曼不動桿菌對外界環(huán)境壓力的相關(guān)應答物質(zhì)，對幫助細菌在外界環(huán)境壓力下生長繁殖具有重要意義[28, 38]。El-Mowafi等[39]發(fā)現(xiàn)，RI20這種物質(zhì)可以抑制Hfq與sRNA的相互作用，從而抑制革蘭陰性致病菌毒力基因的表達，提高細菌對H2O2與抗菌藥物的敏感性。因此，Hfq抑制劑的研發(fā)及運用有望成為對抗細菌耐藥的新策略。

表1 調(diào)控性ncRANs對鮑曼不動桿菌耐藥性或毒力的調(diào)控機制

3.2 核糖開關(guān)靶點 嘌呤合成是細菌繁殖的必需過程，嘌呤核糖開關(guān)廣泛存在于細菌當中。鳥嘌呤類似物5，6-三氨基嘧啶-4-酮配體(PC12)可通過結(jié)合嘌呤核糖開關(guān)抑制金黃色葡萄球菌的生長繁殖[40-41]。類似的核糖開關(guān)如黃素單核苷酸(FMN)核糖開關(guān)，F(xiàn)MN類似物配體在對抗大腸埃希菌感染時表現(xiàn)出良好的活性[42-44]。核糖開關(guān)成為解決日益嚴重耐藥問題的新出口，而這些配體物質(zhì)與抗菌藥物的聯(lián)合運用也是一種抗感染治療的新策略。在鮑曼不動桿菌中為了防止配體與誘導耐藥基因表達的核糖開關(guān)(aac/aad)結(jié)合，以期設(shè)計產(chǎn)生與核糖開關(guān)競爭結(jié)合但不改變核糖開關(guān)結(jié)構(gòu)，不與耐藥基因核糖開關(guān)相互作用的新型小分子物質(zhì)[45]。

3.3 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù) 在對抗耐藥基因方面，改造的CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)已成功應用于細菌。Citorik等[46]構(gòu)建了靶向β-內(nèi)酰胺酶1(NDM-1)基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，幫助細菌對抗NDM-1。Kim等[47]運用CRISPR/Cas9系統(tǒng)恢復了產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)細菌對抗菌藥物的敏感性。Sun等[48]運用CRISPR/Cas9 基因編輯技術(shù)成功敲除了大腸埃希菌中粘菌素耐藥基因mcr-1，使其恢復了對多粘菌素的敏感性。寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院研究人員[49]發(fā)明了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，成功敲除鮑曼不動桿菌的OXA-23基因，恢復了其對亞胺培南的敏感性。將改造的CRISPR/Cas9系統(tǒng)植入耐藥細菌，并破壞相關(guān)耐藥基因，使耐藥菌重新對抗菌藥物敏感，也是一種有效的抗感染策略。

4 結(jié)論

鮑曼不動桿菌中的調(diào)控性ncRNAs(sRNAs、5’UTR或3’UTR調(diào)控元件、CRISPR)具有穩(wěn)定的莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，均具有高度保守性，這種特殊的結(jié)構(gòu)與其調(diào)控細菌的耐藥性、毒力因子等密切相關(guān)[50-52]。ncRNAs在調(diào)控鮑曼不動桿菌生物被膜、藥物外排泵、藥物滅活酶、毒力因子等的表達，以及抵抗外源耐藥基因的入侵等方面起著關(guān)鍵的作用，從而影響細菌的耐藥性和毒力。因此，ncRNAs極具作為藥物靶點的潛在價值，此外針對Hfq、核糖開關(guān)等靶點研發(fā)新的抗菌物質(zhì)，以及開發(fā)出適用于鮑曼不動桿菌的CRISPR/Cas生物靶向制劑，都是解決鮑曼不動桿菌耐藥問題的新思路。但是目前對鮑曼不動桿菌中的調(diào)控性ncRNAs的研究還處在初期探索階段，大量的調(diào)控性ncRNAs，以及其靶基因還有待進一步發(fā)現(xiàn)，調(diào)控性ncRNAs還通過哪些調(diào)控方式參與細菌的耐藥網(wǎng)絡(luò)也有待進一步深入研究。近年來，隨著篩選、鑒定ncRNAs，以及預測其靶基因等的分子生物信息學方法與技術(shù)的發(fā)展[11, 53]，將會有更多的調(diào)控性ncRNAs及其調(diào)控細菌耐藥的相關(guān)作用機制會被發(fā)現(xiàn)。