妊娠早期七氟醚全麻對(duì)仔鼠海馬、頂葉皮質(zhì)中干擾素誘導(dǎo)蛋白表達(dá)及炎性反應(yīng)的影響

烏蘭格日勒,包特博沁,郭念玫,邢文彥

內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院，呼和浩特 010020

七氟醚作為一種具有快速恢復(fù)特性的吸入麻醉劑，被美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)用于住院和門(mén)診手術(shù)的全身麻醉誘導(dǎo)與維持，在臨床中普遍使用，并且成為妊娠期間最常用的麻醉劑之一[1]。然而，隨著人們?cè)絹?lái)越關(guān)注某些麻醉劑對(duì)發(fā)育中大腦的有害作用，在妊娠期間接觸七氟醚麻醉劑可能會(huì)影響胎兒的大腦發(fā)育[2]。在動(dòng)物模型及非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的研究表明，在新生兒和妊娠期胎兒進(jìn)行麻醉后，腦細(xì)胞會(huì)減少甚至喪失功能或死亡，從而導(dǎo)致神經(jīng)認(rèn)知功能受損[3]。因此，在早期大腦發(fā)育過(guò)程中使用麻醉劑可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙和損傷。近年來(lái)對(duì)于七氟醚麻醉安全性的評(píng)估方法主要基于動(dòng)物模型[4]。由于大鼠的神經(jīng)發(fā)育與人類相似，故對(duì)大鼠模型的研究有助于發(fā)現(xiàn)新的治療方案。以往文獻(xiàn)表明，七氟醚引起的神經(jīng)毒性可促進(jìn)海馬發(fā)育的變化[5]。而妊娠早期是整個(gè)大腦皮質(zhì)神經(jīng)元形成的高水平階段，負(fù)責(zé)高級(jí)認(rèn)知功能的海馬發(fā)育在各種神經(jīng)發(fā)育過(guò)程中起重要作用[6]。本研究主要對(duì)妊娠早期大鼠進(jìn)行不同持續(xù)時(shí)間的七氟醚全身麻醉處理，從而評(píng)估仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)中干擾素誘導(dǎo)蛋白(AIM2)表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白CD45、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、pro-caspase-1及caspase-1 p10水平,進(jìn)一步驗(yàn)證其對(duì)炎癥反應(yīng)的影響?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及儀器 選取胎齡為5～7 d的健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠24只，體質(zhì)量260～310g；所有動(dòng)物購(gòu)于南京樂(lè)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格編號(hào)為：SCKL(Nanjing)20190018；于2020年8月—2021年3月在南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室完成動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，將所有動(dòng)物圈養(yǎng)在溫度(23±2)℃、濕度(55±5)%下，光照/黑暗周期為12 h，可自由獲取食物和水。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)于2020年6月通過(guò)南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(0000202037)。每天監(jiān)測(cè)動(dòng)物健康和行為情況，包括飲食、體質(zhì)量、精神狀態(tài)和病死率的評(píng)估。七氟醚購(gòu)自上海熹垣生物科技有限公司(批號(hào)：XY-EP-Y0001057)；蘇木精/伊紅染色劑、尼氏染色劑、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗大鼠AIM2、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG等試劑均購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司(中國(guó))。麻醉氣體檢測(cè)儀購(gòu)自北京康高特儀器設(shè)備有限公司(型號(hào)：FI-8000)；Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)購(gòu)自北京眾實(shí)迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責(zé)任公司(型號(hào)：ZS-001)；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自廣州怡準(zhǔn)化學(xué)科技有限公司(型號(hào)：BX51TF)。

1.2 動(dòng)物分組 將24只妊娠早期SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為對(duì)照組、七氟醚全身麻醉1組(S1組)和七氟醚全身麻醉2組(S2組)，每組8只。

1.3 七氟醚麻醉 將所有妊娠早期SD大鼠置于單獨(dú)的籠子中，并使用100%氧氣作為載氣進(jìn)行處理，總氣體流量為4 L/min。對(duì)照組中的妊娠早期SD大鼠未進(jìn)行七氟醚處理，而S1組和S2組中的妊娠早期SD大鼠用5%的七氟醚麻醉1～2 min，直至失去知覺(jué)，然后使用2%的七氟醚分別在S1組和S2組中持續(xù)麻醉2、4 h。在七氟醚麻醉期間，使用麻醉氣體檢測(cè)儀監(jiān)測(cè)麻醉室內(nèi)的七氟醚、氧氣以及二氧化碳的濃度。按照規(guī)定時(shí)間停止接觸七氟醚后，將妊娠SD大鼠放回籠中直至分娩。對(duì)照組中有36只雌性仔鼠和29只雄性仔鼠。在S1組中，有35只雌性仔鼠和34只雄性仔鼠。在S2組中，有30只雌性仔鼠和35只雄性仔鼠。將仔鼠圈養(yǎng)在溫度(23±2)℃、濕度(55±5)%下，光照/黑暗周期為12 h，可自由獲取食物和水。出生后30 d，從每組中隨機(jī)選擇16只仔鼠[雌雄比例為1∶1，體質(zhì)量為(110±20)g]，通過(guò)腹膜內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)麻醉并斷頭處死，心臟驟停5 min后確認(rèn)死亡，并收集腦組織。取每組8只仔鼠的腦樣本，置于4 ℃的4%多聚甲醛中固定24 h；另取每組其它8只仔鼠的腦樣本,速凍并保存在液氮中,進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法。1.4 妊娠早期七氟醚全身麻醉后仔鼠的活動(dòng)速度、逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)檢測(cè) 采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。每組隨機(jī)抽取8只仔鼠，飼養(yǎng)30 d。準(zhǔn)備一個(gè)水溫為(22±1)℃的圓形游泳池(直徑120 cm、深度40 cm)。將一個(gè)水下站臺(tái)(直徑8 cm、高度35 cm)放置在水池的第一象限中。出生后第30天上午10點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)行測(cè)試，并持續(xù)5 d，每天進(jìn)行4次測(cè)試。將仔鼠在指定的釋放點(diǎn)放入水中，并放置90 s以找到平臺(tái)。在平臺(tái)上放置15 s后，將仔鼠從水池中移出，并終止實(shí)驗(yàn)。如果仔鼠在90 s內(nèi)未能找到平臺(tái)，則將它們手動(dòng)放置在平臺(tái)上15 s。記錄仔鼠的活動(dòng)速度、逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)，并移除平臺(tái)進(jìn)行探索實(shí)驗(yàn)，如既往文獻(xiàn)所述[7]。

1.5 妊娠早期七氟醚全身麻醉后仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)特征的觀察 各組腦組織進(jìn)行脫水后，將腦標(biāo)本固定在4%的多聚甲醛溶液中，并包埋在石蠟中。腦組織的石蠟塊包括海馬和頂葉皮質(zhì)部分(切片厚度5 μm)。通常在60 ℃下用二甲苯對(duì)切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟，然后使用分級(jí)乙醇系列進(jìn)行水合。在室溫下，用蘇木精對(duì)組織染色5 min，自來(lái)水沖洗。然后使用鹽酸和乙醇將組織分化30 s，在室溫下浸入自來(lái)水中15 min，然后在室溫下將其浸入伊紅染色溶液中2 min。所有樣品常規(guī)脫水并密封。對(duì)于尼氏染色，將切片在37 ℃下孵育過(guò)夜，重新水化，室溫下進(jìn)行尼氏染色10 min。400倍光學(xué)顯微鏡下觀察海馬和頂葉皮層中神經(jīng)元的形態(tài)。

1.6 妊娠早期七氟醚全身麻醉后仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元AIM2表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化法。對(duì)海馬和頂葉皮層組織(切片厚度5 μm)進(jìn)行常規(guī)切片后，將標(biāo)本在60 ℃下用二甲苯脫蠟，并用一系列分級(jí)的乙醇溶液水合。將切片在室溫下用3%H2O2滅活20 min，在檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)中固定，并通過(guò)高溫加熱煮沸10 min，然后用5%BSA處理,室溫下放置20 min。加入兔抗大鼠AIM2(1∶200)，并將組織在4 ℃下孵育過(guò)夜。重新加熱后，將標(biāo)本與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1 000)一起孵育。切片用3,3′-二氨基聯(lián)苯胺顯影，然后在室溫下與蘇木精染色10 min，脫水，清除并密封。400倍光學(xué)顯微鏡上觀察相關(guān)大腦區(qū)域(每個(gè)樣品隨機(jī)選擇5個(gè)視野)，并使用Aperio ImageScope 11.1軟件對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7 妊娠早期七氟醚全身麻醉后仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)中CD45、IL-1β、pro-caspase-1和caspase-1 p10蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用蛋白印跡法。將海馬和頂葉皮質(zhì)的部分磨碎，并使用總蛋白提取試劑盒進(jìn)行均質(zhì)化。在4 ℃下以12 000×g離心10 min后，棄上清液，并使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用5∶1的蛋白質(zhì)上樣緩沖液以1∶1稀釋液通過(guò)通過(guò)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)(10%凝膠)分離出總共40 μg蛋白質(zhì)/泳道，95 ℃加熱5 min。然后將樣品在80 V的電壓下轉(zhuǎn)移至PVDF膜30 min，4 ℃下用含5%脫脂奶粉、0.1%Tween-20(TBST)溶液的TBS密封1 h。用含有3%BSA的TBST溶液稀釋兔抗大鼠CD45、IL-1β、pro-caspase-1、caspase-1 p10和β-actin多克隆抗體，并在4 ℃下過(guò)夜探測(cè)膜。重新加熱后，將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶1 000)在室溫下孵育1 h，然后用ECL洗滌3～5 min。將蛋白質(zhì)水平標(biāo)準(zhǔn)化為β-actin蛋白水平，并使用ImageJ軟件進(jìn)行灰度掃描和半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 試妊娠早期七氟醚全身麻醉對(duì)仔鼠的活動(dòng)速度、逃避潛伏期、穿越平臺(tái)次數(shù)的影響 三組仔鼠的活動(dòng)速度比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，如表1所示。在訓(xùn)練第3～5天，三組仔鼠的逃避潛伏期總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，S1組、S2組仔鼠在訓(xùn)練第2～5天的逃避潛伏期顯著增加(P<0.05)，而且S2組高于S1組(P<0.05)，如表2所示。三組仔鼠穿越平臺(tái)的次數(shù)差異總體比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.278,P>0.05)，進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組(2.13±0.64)相比，S1組(0.63±0.52)和S2組(0.25±0.46)穿越原平臺(tái)的次數(shù)減少(P<0.05)。S2組仔鼠的學(xué)習(xí)能力較差。

表1 三組仔鼠的活動(dòng)速度比較

表2 三組仔鼠的逃避潛伏期比較

2.2 妊娠早期七氟醚全身麻醉對(duì)仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元形態(tài)特征的影響 蘇木精/伊紅染色、尼氏染色結(jié)果顯示，對(duì)照組仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元大小均勻、排列整齊以及輪廓清晰；與對(duì)照組相比，S1組的神經(jīng)元細(xì)胞排列相對(duì)整齊，少數(shù)表現(xiàn)出腫脹和神經(jīng)元變性；而S2組的神經(jīng)元細(xì)胞無(wú)序排列，細(xì)胞體收縮并且細(xì)胞核濃縮成三角形或多邊形。尼氏染色結(jié)果表明，對(duì)照組仔鼠的海馬和頂葉皮質(zhì)具有正常、清晰和完整的尼氏體；與對(duì)照組相比，S1組和S2組尼氏體呈彌散分布；而在S2組，尼氏體比S1組更彌散。

2.3 妊娠早期七氟醚全身麻醉對(duì)仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元AIM2表達(dá)的影響 見(jiàn)表3。

表3 三組仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)神經(jīng)元AIM2陽(yáng)性表達(dá)率比較

2.4 三組仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)中CD45、IL-1β、pro-caspase-1和caspase-1 p10蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表4。

表4 三組仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)中炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)比較

3 討論

七氟醚是一種廣泛應(yīng)用于外科手術(shù)的麻醉藥，安全性較高[8]。然而，最近研究表明，七氟醚對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有神經(jīng)毒性作用，如七氟烷導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯并影響神經(jīng)發(fā)育,同時(shí)七氟醚與神經(jīng)元死亡的誘導(dǎo)有直接關(guān)系[9]。由于藥物反應(yīng)、胚胎發(fā)育的劑量和時(shí)間尺度及其他混雜變量的差異，研究結(jié)論有所差異[10]。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是目前評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶的一種經(jīng)典方法。本研究結(jié)果表明，S2組仔鼠的學(xué)習(xí)能力較差，說(shuō)明妊娠早期七氟醚全身麻醉對(duì)仔鼠的學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能有一定損傷，與既往文獻(xiàn)[11]報(bào)道較一致。本研究還通過(guò)蘇木精/伊紅染色、尼氏染色觀察發(fā)現(xiàn)，S1組和S2組的神經(jīng)元細(xì)胞排列、形態(tài)以及尼氏體的分布出現(xiàn)異常，進(jìn)一步說(shuō)明妊娠早期七氟醚全身麻醉對(duì)仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)的損害。

由于麻醉劑會(huì)對(duì)發(fā)育中的大腦造成嚴(yán)重?fù)p害，損害程度主要取決于麻醉劑的濃度和暴露時(shí)間[12]。因此，本研究將妊娠早期大鼠暴露于濃度為2%的七氟醚，并選擇2、4 h的七氟醚暴露時(shí)間。AIM2作為一種炎性細(xì)胞因子，在防御細(xì)菌和病毒成分中起重要作用，并且是評(píng)估腦部變化的可靠指標(biāo)[13]。本研究中，與對(duì)照組比較，S1組和S2組仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)中AIM2的表達(dá)增加，妊娠早期七氟醚全身麻醉對(duì)仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)會(huì)產(chǎn)生炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果表明，S1組和S2組仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)中CD45、IL-1β、pro-caspase-1和caspase-1 p10的蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組，且S2組高于S1組。CD45是淋巴細(xì)胞的公共抗原，是一種與受體相關(guān)的蛋白酪氨酸磷酸酶，在白細(xì)胞功能中起重要作用[14]。本研究結(jié)果與既往研究一致，表明在妊娠早期中使用七氟醚麻醉可能會(huì)影響胎兒大腦的發(fā)育[15]。海馬和頂葉皮層的異常通常會(huì)導(dǎo)致精神障礙，如自閉癥譜系障礙和神經(jīng)退行性變[16]。IL-1β是關(guān)鍵的促炎性細(xì)胞因子，對(duì)于宿主對(duì)損傷和感染的防御反應(yīng)至關(guān)重要。pro-caspase-1是一種功能性酶，可通過(guò)蛋白水解方式切割其他蛋白質(zhì)，如炎性細(xì)胞因子IL-1的前體，因此在細(xì)胞免疫中起炎性反應(yīng)引發(fā)劑的作用。一旦被激活，pro-caspase-1通常會(huì)通過(guò)裂解而引發(fā)促炎性反應(yīng)，從而激活兩種炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18[17]。本研究中仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)中CD45、IL-1β、pro-aspase-1和caspase-1 p10蛋白表達(dá)出現(xiàn)變化，表明妊娠早期七氟醚的暴露對(duì)胎兒大腦的不同區(qū)域有嚴(yán)重影響，包括海馬和頂葉皮質(zhì)，最終可能導(dǎo)致后代的大腦功能和神經(jīng)損傷。

綜上所述，妊娠早期七氟醚全身麻醉促進(jìn)了仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)中AIM2的表達(dá)，并進(jìn)一步促進(jìn)了仔鼠海馬和頂葉皮質(zhì)的炎癥反應(yīng)。