重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠對皮膚創(chuàng)口愈合的療效及其機制

羊劍秋，高以紅，朱紅柳

南京中醫(yī)藥大學(xué)江陰附屬醫(yī)院皮膚科，江蘇江陰214400

皮膚因手術(shù)、感染、燒燙傷等各種原因形成的瘢痕影響人體美觀，可對患者的日常生活和社會活動造成嚴重影響。隨著時代的發(fā)展和生活水平的提高，人們對瘢痕美化要求的越來越高，故各種成分的祛疤制劑如硅酮類凝膠、動物膠原蛋白凝膠和類人膠原蛋白凝膠等[1]相繼出現(xiàn)。重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠是一種新型膠原蛋白，可以外源性地給予皮膚補充膠原蛋白，連接皮膚因創(chuàng)傷和感染造成的皮膚纖維斷裂，抑制黑色素生成，抑制瘢痕，加速皮膚愈合[2]。目前，該藥的臨床應(yīng)用效果報道較少，為此我們就其對創(chuàng)口愈合的療效及其機制進行了探討。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取本院2019年6月—12月收治手術(shù)或外傷無明顯感染皮膚創(chuàng)口患者60例，男24例、女36例，年齡24～45(35.27±3.6)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①性別不限，手術(shù)或外傷后4周內(nèi)創(chuàng)口，未愈合且未形成瘢痕；②創(chuàng)口無明顯感染；③患者尚未接受過其他治療；排除標(biāo)準(zhǔn)：①瘢痕體質(zhì)患者；②有傳染性疾病或其他免疫系統(tǒng)重大疾病患者。60例患者采用隨機數(shù)字表法分為對照組和觀察組各30例，兩組性別、年齡、臨床癥狀體征比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。本研究獲本院倫理委員會批準(zhǔn)實施，患者及其家屬均知曉并簽署同意書。

1.2 治療方法 對照組采用類人膠原蛋白疤痕修復(fù)硅凝膠，根據(jù)產(chǎn)品說明書，創(chuàng)口首次清創(chuàng)1周后開始使用，持續(xù)使用12周后停藥。觀察組采用重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠(山西錦波生物醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)，晉械注準(zhǔn)2014264011，每瓶30 g)，從創(chuàng)口首次清創(chuàng)后第3天開始使用，持續(xù)使用12周后停藥。兩組治療前保證創(chuàng)口干燥和潔凈，取適量凝膠在創(chuàng)口處涂抹均勻，每日3次。

1.3 檢測方法 兩組治療前、治療第6周分別行外科顯微手術(shù)切取創(chuàng)口組織或瘢痕組織，以0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm大小置于液氮中保存?zhèn)溆?，進行以下檢測。

1.3.1 羥脯氨酸水平檢測 根據(jù)劉平譯《膠原蛋白實驗方法》中提取膠原蛋白的方法提取創(chuàng)口組織或瘢痕組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白，將蛋白提取物凍干粉100 mg溶解于1 mL乙酸中，于560 nm波長處在分光光度計下測量羥脯氨酸吸光度。羥脯氨酸水平(mmol/L)=樣品吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×0.15。

1.3.2 Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白比值測定 取0.1 cm×0.1 cm×0.1 cm的樣本加入5% SDS溶液中，使其樣本∶溶液比例為4∶1。85 ℃水浴45 min，室溫下以10 000 g力離心5 min，取上清液15 μL于離心管中，加入5 μL硫基緩沖液，振蕩混勻。在95 ℃水浴3 min，室溫下以10 000 g力離心5 min，取上清液電泳。采用SDS-Tris-甘氨酸系統(tǒng)電泳緩沖液，0.1%考馬斯亮藍-CH3OH-CHCOOH(9∶9∶2)作為染色液，水-CH3OH-CHCOOH(8∶1∶1)作為脫色液進行電泳4 h。采用Ⅰ型和Ⅲ型標(biāo)準(zhǔn)膠原蛋白定位，根據(jù)儀器分析讀取檢測樣本Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白灰度值。Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白比值=Ⅰ型膠原蛋白灰度值/Ⅲ型膠原蛋白灰度值×1.5。

1.4 瘢痕狀態(tài)及療效評價

1.4.1 創(chuàng)口容積縮小率 治療前、治療1、2、4周時分別測量創(chuàng)口容積并記錄。測量方法：將醫(yī)用超聲耦合劑注入帶刻度的注射器內(nèi)，推注射器將耦合劑至創(chuàng)口，以抹平創(chuàng)口耦合劑的劑量作為創(chuàng)口容積，測量后將耦合劑沖洗干凈。創(chuàng)口容積縮小率=(1-目前創(chuàng)口容積/治療前創(chuàng)口容積)×100%。

1.4.2 瘢痕狀態(tài)評定 在治療12周和停藥12周時根據(jù)溫哥華瘢痕量表(VSS)評估瘢痕狀態(tài)，包括色澤(0～3分)、柔軟度(0～5分)、厚度(0～4分)。評分越高瘢痕越嚴重。

1.4.3 臨床療效評定 停藥12周測量瘢痕容積，方法同創(chuàng)口容積。臨床療效評價標(biāo)準(zhǔn)：①基本治愈：皮膚基本無肉眼瘢痕印記；②顯效：皮膚瘢痕容積減少超過治療前創(chuàng)口容積一半；③有效：皮膚瘢痕的容積減少超過治療前創(chuàng)口容積的25%；④無效：皮膚瘢痕容積沒有減少。

2 結(jié)果

2.1 兩組創(chuàng)口容積縮小率 兩組治療1、2、4周創(chuàng)口容積縮小效率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表1。觀察組創(chuàng)口容積縮小率增大，創(chuàng)口容積縮小，創(chuàng)口愈合加快。

表1 兩組不同檢測時點創(chuàng)口容積縮小率比較

2.2 兩組瘢痕狀態(tài)比較 治療12周、停藥12周，觀察組VSS評分中瘢痕色澤、厚度以及柔軟度評分均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表2。

表2 兩組瘢痕色澤、厚度及柔軟度VSS評分比較(分，

2.3 兩組臨床療效比較 停藥12周，觀察組顯效18例、有效9例、無效3例，總有效率90.00%；對照組顯效12例、有效11例、無效7例，總有效率76.67%。觀察組臨床療效優(yōu)于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 兩組羥脯氨酸水平及Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白值比較 治療前兩組羥脯氨酸及Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比值水平無統(tǒng)計學(xué)差異(P均>0.05)；治療6周，觀察組羥脯氨酸水平、Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比值低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見表3。

表3 兩組羥脯氨酸水平及Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白值比較

3 討論

瘢痕是創(chuàng)口愈合的必然結(jié)果，通常會導(dǎo)致患者外觀美學(xué)上的不足、組織運動受限和負面心理壓力[3]。創(chuàng)口愈合一般可分為3個主要階段，即炎癥、增殖和重塑。炎癥始于毛細血管破壞和止血級聯(lián)反應(yīng)的誘導(dǎo)[4]。破損血管中的內(nèi)容物形成由纖維蛋白網(wǎng)狀物和血小板組成的纖維蛋白凝塊，為臨時細胞外基質(zhì)；這些臨時細胞外基質(zhì)可為參與創(chuàng)口愈合過程的各種細胞遷移提供便利。創(chuàng)口愈合的第2階段是增殖，在創(chuàng)傷第4天或第5天開始，成纖維細胞遷移到創(chuàng)口臨時細胞外基質(zhì)聚集部位。至創(chuàng)傷2～4周，成纖維細胞最大限度地上調(diào)，并用更堅固的膠原纖維基質(zhì)取代纖維蛋白。在增殖成熟的創(chuàng)口中，不能再觀察到初始的彈性纖維網(wǎng)絡(luò)，這也是瘢痕堅固和缺乏彈性的原因[5]。增殖期的另一個重要方面是創(chuàng)口邊緣的角質(zhì)形成細胞內(nèi)皮化。創(chuàng)口收縮在創(chuàng)傷發(fā)生后第10～12天開始，但這一時間可能會隨著創(chuàng)口的嚴重程度和患者的一般情況而變化[6]。創(chuàng)口愈合的第3個亦是最后1個階段是重塑階段，通常在組織損傷后第3周開始。這一階段顯微鏡下表現(xiàn)包括成纖維細胞數(shù)量減少、血管閉塞和膠原纖維硬化[7]。持續(xù)膠原蛋白的產(chǎn)生和降解會對成熟創(chuàng)口基質(zhì)進行大約6個月的重塑。傷后幾個月的時間內(nèi)，膠原蛋白生產(chǎn)和退化相互維持平衡，使其總含量無明顯變化[8]。在重塑階段，正在愈合的創(chuàng)口會形成瘢痕。創(chuàng)口瘢痕形成的可調(diào)節(jié)因素包括創(chuàng)口設(shè)計、軟組織無創(chuàng)處理、止血、無菌技術(shù)以及術(shù)后皮膚短期或長期張力降低等方法[9]。增殖期甚至在炎癥階段完成之前就已經(jīng)開始了，即使重塑已經(jīng)出現(xiàn)，增殖期仍在繼續(xù)。在拆除縫合線和停止使用敷料后很長一段時間內(nèi)，組織重塑過程仍在繼續(xù)。因此，創(chuàng)口的護理被認為是一個持續(xù)的過程，最大限度地減少瘢痕的形成應(yīng)該是一個長期目標(biāo)。

膠原蛋白是細胞外基質(zhì)的主要組成成分，是動物體內(nèi)分布最多、含量最廣的蛋白質(zhì)，主要分布在哺乳動物的結(jié)締組織中。在人體組織中，膠原蛋白占干重的70%～80%，其類型主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白[10]。嬰幼兒皮膚中的膠原蛋白主要是Ⅲ型，青壯年和老年人皮膚中的膠原蛋白主要是Ⅰ型。Ⅰ型膠原蛋白決定皮膚輪廓支撐，Ⅲ型膠原蛋白決定皮膚彈性及細膩程度。Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白水平與皮膚的年輕程度、創(chuàng)傷修復(fù)、細胞支撐與再生等行為緊密相關(guān)[11]。因上皮破損和皮膚萎縮等癥狀都伴隨著膠原蛋白的大量流失，故修復(fù)皮膚的主要途徑就是大量補充膠原蛋白。目前，市場上應(yīng)用的各類膠原蛋白產(chǎn)品大多是動物膠原蛋白或者類人源膠原蛋白，主要來自于常見動物如豬、魚的皮膚。這類產(chǎn)品膠原蛋白的類型主要是Ⅰ型[12]。因提取手段不夠成熟，膠原蛋白的活性結(jié)構(gòu)常常會遭到破壞，最終產(chǎn)品主要以膠原蛋白短肽的形式存在，無法發(fā)揮膠原蛋白的功能，還存在著動物源病毒污染和過敏的風(fēng)險[13-14]。

重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠是一種通過基因工程技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)出來的膠原蛋白凝膠。制作時首先將源自于人類基因庫中的一段Ⅲ型膠原蛋白的基因序列挑選出來，然后通過基因重組的方式將這段經(jīng)過篩選的優(yōu)良基因片段導(dǎo)入到工程菌中，再通過基因工程發(fā)酵，將氨基酸原料合成為擁有活性結(jié)合位點的大分子人源Ⅲ型膠原蛋白，三條多肽鏈之間依靠多組氫鍵網(wǎng)絡(luò)進一步穩(wěn)定三螺旋構(gòu)型，增強了該蛋白的穩(wěn)定性[15]。而且，這一段Ⅲ型膠原蛋白區(qū)域在晶體中呈現(xiàn)出164.88°的柔性彎折結(jié)構(gòu)，更利于該蛋白緊密結(jié)合細胞。羥脯氨酸是膠原蛋白的特征性氨基酸，并且在膠原中的含量較為恒定, 占膠原蛋白氨基酸總量的13%，其水平變化可反映皮膚組織總體膠原蛋白含量變化。皮膚組織中若羥脯氨酸水平過高，則表示膠原蛋白含量過高，提示創(chuàng)口會過度增生出現(xiàn)不同程度的瘢痕。本研究顯示，治療6周觀察組瘢痕組織羥脯氨酸含量顯著低于對照組，提示瘢痕組織增生程度低；而且Ⅰ型/Ⅲ型膠原蛋白比值低于對照組，提示觀察組通過外源性補充重組人源Ⅲ型膠原蛋白，創(chuàng)面局部Ⅲ型膠原蛋白水平升高，從而抑制Ⅰ型膠原蛋白過度分泌造成組織過度增生及瘢痕形成，保持皮膚的良好彈性和柔嫩度，因此觀察組皮膚愈合效果非常理想。

本研究結(jié)果顯示，兩組治療1、2、4周，觀察組創(chuàng)口容積縮小率均較對照組升高；治療12周及停藥12周，觀察組瘢痕色澤、厚度以及柔軟度評分均低于對照組；治療后6周觀察組瘢痕組織羥脯氨酸含量降低、Ⅲ型膠原蛋白比例增高；觀察組臨床治療總有效率高于對照組。此機制是由于觀察組外源性補充人源Ⅲ型膠原蛋白，通過其強大的黏附性，有效連接因創(chuàng)傷造成的皮膚斷裂的膠原纖維，從而提高細胞活性，填補細胞間質(zhì)的空隙，增強細胞間的支撐結(jié)構(gòu)，快速重建皮膚屏障功能。重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠的酪氨酸殘基與皮膚的酪氨酸競爭，與酪氨酸酶的活性中心結(jié)合，從而抑制酪氨酸酶催化酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴醌，也可有效防止皮膚損傷部位的黑色素沉著。

綜上所述，外源性補充重組人源Ⅲ型膠原蛋白功能凝膠可有效提高創(chuàng)面局部Ⅲ型膠原蛋白水平，從而抑制Ⅰ型膠原蛋白過度分泌造成組織異常增生及瘢痕形，減少色素沉淀，臨床治療效果良好。但本研究樣本數(shù)量較少，該藥物的確切療效還需要大樣本的臨床實驗觀察證實。