運(yùn)脾化濁顆粒對(duì)糖尿病合并脂肪肝大鼠模型的干預(yù)機(jī)制

肖 洋，柯 婷，李 婷，王高雷，杭 程，王露露，師韓菲，董丹丹，祁海燕

(陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003)

隨著現(xiàn)代社會(huì)生活水平不斷提高，糖尿病合并脂肪肝人群與日俱增。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查研究顯示，健康人群脂肪肝發(fā)病率約為20%～30%[1]，而在糖尿病患者人群中約76%患者合并脂肪肝，脂肪肝患者血糖損害或糖尿病發(fā)病率約18%～33%[2-3]。長期糖脂代謝紊亂可導(dǎo)致血管、神經(jīng)、心臟等組織器官功能缺陷和衰竭，加重肝臟脂肪樣變，可進(jìn)一步產(chǎn)生或加重肝臟細(xì)胞癌變及心血管事件風(fēng)險(xiǎn)，嚴(yán)重危害人類健康[4-6]。目前公認(rèn)的胰島素抵抗是兩者共同發(fā)病機(jī)制，胰島β細(xì)胞為維持體內(nèi)血糖平穩(wěn)，肝臟組織在胰島素抵抗下，需分泌胰島素代償，導(dǎo)致高胰島素血癥，且需提高內(nèi)固醇調(diào)控組件蛋白1-C(SREBP-1c)及肝X受體(LXR)的呈現(xiàn)。平衡體內(nèi)脂肪生成基因表達(dá)的SREBP-1c，升高脂肪酸合成作用，加速肝細(xì)胞內(nèi)脂肪儲(chǔ)存。LXR是新發(fā)現(xiàn)的一種肝臟內(nèi)脂質(zhì)調(diào)節(jié)因子，其可與SREBP-1c形成正反饋調(diào)節(jié)回路，參與調(diào)控肝臟內(nèi)的脂質(zhì)生成過程。另外，葡萄糖可通過激活轉(zhuǎn)錄因子碳水化合物反應(yīng)原件結(jié)合蛋白(ChREBP)表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸生物合成。ChREBP亦可促進(jìn)肝臟內(nèi)丙酮酸激酶活性，為肝臟游離脂肪酸(Free fattyacids,FFAs)和甘油三酯(Triglyceride，TG)合成提供底物。因此，ChREBP成為中藥干預(yù)研究的重要靶點(diǎn)[7]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為糖尿病屬“消渴”范疇，主要病機(jī)為氣陰兩傷、血瘀于絡(luò)，而脂肪肝屬“淤濁”，發(fā)病機(jī)制乃情志不舒、肝郁氣滯、氣滯血瘀、濕痰內(nèi)停、痰瘀痹阻肝絡(luò)[8]。凡飲食不節(jié)，過食肥甘厚膩之品，胃不主受納，陽明胃腸生熱化燥傷津，“脾胃同居中焦”，胃腸燥熱太過，則反傷脾氣，脾不主運(yùn)化，氣機(jī)不行，清陽不升，濁陰不降，清濁互亂于中，痰飲內(nèi)生，郁滯中焦；日久疾病由太陰發(fā)展至厥陰。“肝屬木，腎屬水，肝為腎之子，母欲受邪，子先代之”，故本病核心病機(jī)為“胃熱脾困、痰濁瘀結(jié)”[9]。針對(duì)這一病機(jī)，設(shè)辛開脾困、苦降胃熱、酸化陰精之法，研制運(yùn)脾化濁方，本方具有清熱降氣、開郁運(yùn)脾、化痰活血之功。該方前期經(jīng)過大量臨床療效觀察，可有效改善機(jī)體糖、脂代謝及胰島素抵抗[10-11]。同時(shí)研究證實(shí)，運(yùn)用運(yùn)脾化濁方辛開脾困、苦降胃熱、酸化陰精，可有效改善該類患者肝脾CT比值及胰島素抵抗指數(shù)，其安全性較高，臨床療效較好[12]。

本研究通過建立2型糖尿病合并脂肪肝大鼠模型，通過運(yùn)脾化濁中藥單用，西藥單用及運(yùn)脾化濁中藥聯(lián)合西藥的干預(yù)，闡述運(yùn)脾化濁方對(duì)模型大鼠生化指標(biāo)的影響、肝臟病理變化，并運(yùn)用PCR法檢測(cè)蛋白SREBP-1、ChREBP、PPARa和調(diào)節(jié)因子LXR的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：選用SPF級(jí)SD健康雄性大鼠33只(許可證號(hào)NO1103222011002509，北京華阜康公司)，體重(100±20)g。飼養(yǎng)于干凈實(shí)驗(yàn)室，環(huán)境溫度為(21±3)℃，相對(duì)濕度為60%～80%，自然光照射。保持安靜環(huán)境，自由飲水進(jìn)食。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑：運(yùn)脾化濁免煎制劑由陜西省中醫(yī)醫(yī)院米氏內(nèi)科內(nèi)分泌二科提供，陜西省中醫(yī)醫(yī)院中藥免煎制劑中心配制。鏈脲佐菌素(Streptozocin)批號(hào)：S1030-100mg。DEPC水：1 ml DEPC加入1000 ml雙蒸水中，37 ℃飽和24 h后121 ℃濕熱滅菌30 min配成1‰ DEPC水。ligo(dT)18 Primers (TaKaRa D511)：首次使用時(shí)溶于280 μl DEPC水。1.5 mmol/L Tris-HCl pH 8.8緩沖液(貨號(hào)Cat#T1010)、1 mmol/L Tris-HCl pH 6.8緩沖液(貨號(hào)Cat#T1020)、30%的丙烯酰胺制膠液(29∶1)(貨號(hào)Cat#A1010)、RIPA裂解液(貨號(hào)P0013B)、TEMED(貨號(hào)L19S10G98319)、B10FROXX(貨號(hào)4240GR100)、過硫酸銨(貨號(hào)A1004)。TWEEN 20(貨號(hào)：1247ML500)；甘氨酸(貨號(hào)Cat#G8200)；Tris(貨號(hào)1115GR500)；氯化鈉；抗體PPAR-a(抗體名52KD)；WBSCR(抗體名93KD)；SREBP-1(抗體名122KD)；LXR-A(抗體名50KD)；Gapdh (抗體名37KD)；Goat Anti-Rabbit IgG(二抗)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器：離心機(jī)(德國Eppendorf-5430)、包埋機(jī)(型號(hào)KD-BM，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)、病理切片機(jī)(型號(hào)KD-2258，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)、攤片機(jī)(型號(hào)KD-P，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)、凍臺(tái)(型號(hào)KD-BL，浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)、烤箱(型號(hào)PHG-9070A，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、載玻片及蓋玻片(型號(hào)10212432C，江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司)、正置光學(xué)顯微鏡(型號(hào)OLYMPUS CK31，日本奧林巴斯)、成像系統(tǒng)(型號(hào)TVO.63XC-MO，明美Mshot)、鼓風(fēng)式干燥箱(型號(hào)101-3，上海錦屏儀器儀表有限公司)、蒸氣消毒器(型號(hào)YXQG02，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司)、電熱式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(型號(hào)DHG-9145A，上海一恒科技有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 所有實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按照隨機(jī)數(shù)字表分為兩組，除空白組予以0.9%氯化鈉溶液外，余組大鼠均予以高糖高脂(成分：10%蔗糖、10%蛋黃、10%豬油、1.5%膽固醇、0.5%膽鹽、68%基礎(chǔ)飼料混合)飼料喂養(yǎng)1個(gè)月后，連續(xù)5 d每天給予STZ 40 mg/(kg·d)，腹腔內(nèi)注射，STZ 7 d后，用血糖儀取尾靜脈血測(cè)空腹血糖，以連續(xù)3 d大鼠空腹血糖值(FBG)高于11.1 mmol/L作為大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)。成模后繼續(xù)給予高糖高脂飲食喂養(yǎng)1個(gè)月，建立非酒精性脂肪肝大鼠模型。將造模成功的糖尿病大鼠隨機(jī)分為四組，運(yùn)脾化濁組、運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組、二甲雙胍組、模型組。正常組每日予以0.9%氯化鈉溶液灌胃1 ml/只；運(yùn)脾化濁組每日予以免煎中藥灌胃3 ml/只；運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組每天灌胃運(yùn)脾化濁顆粒2 ml/只、二甲雙胍1 ml/只；二甲雙胍組每天灌胃3 ml/只。治療8周結(jié)束后3 d處死大鼠，取全血或血清檢測(cè)生化指標(biāo)，取肝臟組織進(jìn)行HE染色觀察。

取肝臟組織樣品(約30～100 mg)分放入盛有1 ml變性緩沖液(TRIZOL)的手動(dòng)勻漿器中，在冰浴中充分勻漿。將勻漿液移至1.5 ml的Eppendorf管中，15～30 ℃靜置5 min。加入0.2 ml氯仿充分混勻15 s，15～30 ℃下靜置2～3 min，4 ℃下12000 r/min離心15 min。取上層水相置于新的EP管內(nèi)，加入等體積的異丙醇，混勻后靜置10 min，4 ℃下12000 r/min離心10 min。棄去上清，加入1 ml的80 %乙醇清洗沉淀，4 ℃下10000 r/min轉(zhuǎn)離心10 min。清洗2次，室溫風(fēng)干沉淀約20 min，用30 μl DEPC水溶解沉淀，取1 μl稀釋100倍后測(cè)OD260。計(jì)算濃度：RNA濃度(μg/μl)=OD260×40×稀釋倍數(shù)/1000。進(jìn)行RT反應(yīng)，制備cDNA模板，再進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠肝臟病理變化 各組大鼠的病理表現(xiàn)，見圖1。正常對(duì)照組：肝組織結(jié)構(gòu)清晰完整，肝小葉結(jié)構(gòu)正常，以中央靜脈為中心向四周放射的肝細(xì)胞排列整齊，肝竇清晰可見，肝細(xì)胞內(nèi)無脂滴沉積和炎細(xì)胞浸潤。模型組：肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)紊亂，呈中-重度脂肪變性。肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，可見腫脹和氣球樣變肝細(xì)胞，肝細(xì)胞索模糊不清，肝竇消失。運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組：大部分肝臟組織恢復(fù)正常，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索排列呈放射狀，少量小脂滴存在于胞漿內(nèi)，細(xì)胞核位置居中，無炎細(xì)胞浸潤。二甲雙胍組：肝細(xì)胞索較整齊，肝細(xì)胞輕度腫脹，有大小不等的圓形脂滴空泡存在于胞質(zhì)內(nèi)，細(xì)胞核不居中。運(yùn)脾化濁組：肝小葉結(jié)構(gòu)清晰度尚可，肝索排列呈放射狀。

圖1 各組大鼠肝臟病理表現(xiàn)(HE染色，×10)

2.2 各組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、游離脂肪酸(FFA)及甘油三酯(TG)比較 見表1。各組大鼠血清ALT比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=15.587，P<0.01)。各組大鼠血清ALT比較，正常對(duì)照組較其他各組大鼠ALT無明顯升高(P<0.01)，二甲雙胍組與運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說明應(yīng)用二甲雙胍比聯(lián)合運(yùn)脾化濁方案能更有效改善大鼠ALT水平。各組大鼠血清AST、FFA水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，說明二甲雙胍與運(yùn)脾化濁方在改善大鼠血清AST、FFA效果相當(dāng)。正常對(duì)照組大鼠血清TG與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組比模型組能更有效的改善大鼠TG水平。

表1 各組大鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、游離脂肪酸、甘油三酯比較

2.3 各組大鼠ChREBP、SREBP-1、LXR及PPARa比較 見表2。模型組大鼠ChREBP水平高于正常對(duì)照組、運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組、運(yùn)脾化濁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。二甲雙胍組ChREBP水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組大鼠SREBP-1水平高于運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組、二甲雙胍組、運(yùn)脾化濁組的LSR水平均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組的LSR水平低于二甲雙胍組、運(yùn)脾化濁組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組、二甲雙胍組、運(yùn)脾化濁組的PPARa水平均高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組的PPARa水平高于二甲雙胍組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；運(yùn)脾化濁聯(lián)合二甲雙胍組的PPARa水平低于運(yùn)脾化濁組，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠血清ChREBP、SREBP-1、LXR、PPARa蛋白表達(dá)比較

3 討 論

糖尿病合并脂肪肝是臨床常見代謝性疾病，胰島素抵抗是糖尿病與脂肪肝共同發(fā)病機(jī)制[13]，目前認(rèn)為脂肪肝發(fā)病機(jī)制為“二次打擊”。胰島素抵抗引起肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積并誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)內(nèi)源性損害因子的敏感性增加即為“第一次打擊”；在此基礎(chǔ)上，被活化因子通過氧化應(yīng)激與脂質(zhì)過氧化等反應(yīng)，損傷肝細(xì)胞，促進(jìn)肝臟炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致肝臟細(xì)胞壞死或纖維化，即為“二次打擊”[14-15]。因此當(dāng)前治療本病研究熱點(diǎn)之一即調(diào)節(jié)糖脂代謝、改善胰島素抵抗。中醫(yī)藥能改善胰島素抵抗、抑制脂質(zhì)過氧化，減少氧化應(yīng)激，調(diào)控“二次打擊”內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[16]。

運(yùn)脾化濁方基于“胃熱脾困、痰濁瘀結(jié)”病機(jī)而立，本方以半夏瀉心湯化裁，半夏、干姜、薤白味辛，開散郁滯而化痰濁；脾主升清、胃主降濁，氣滯則濕阻，濕滯而化熱，熱郁生痰，痰瘀互結(jié)，久病陳疴[17]，故以黃連、黃芩、郁金、決明子味苦，瀉脾胃、腸道之郁熱；黨參、薏苡仁、甘草味甘，健運(yùn)脾氣，并能預(yù)防苦寒藥物損傷脾胃[18]。張錫純言：“苦以甘藥佐之，化瘀血而不傷新血，開郁氣而不傷正氣，其性尤和平也?！鄙介岣?，善消肉食、油膩之積滯，兼有行氣化瘀之效，調(diào)暢氣機(jī)而助辛甘諸藥消食化痰，白芍?jǐn)筷幦岣蝃19]。有研究證實(shí)，白芍有效成分能抗血栓、降脂、降糖、保肝，改善缺血等[20]。丹參、郁金、川芎、三七四味，活血化痰、行氣斂陰，既能祛除機(jī)體產(chǎn)生之瘀，又能預(yù)防體內(nèi)瘀血的產(chǎn)生。全方以辛開、苦降、酸化三法合用，共奏開郁運(yùn)脾、清瀉郁熱、酸化陰精、化痰活血之功。

本實(shí)驗(yàn)通過建立糖尿病合并脂肪肝大鼠模型，應(yīng)用運(yùn)脾化濁顆粒與鹽酸二甲雙胍片進(jìn)行對(duì)照研究。結(jié)果表明，二甲雙胍降酶優(yōu)于運(yùn)脾化濁顆粒，兩者在降脂及ChREBP方面具有等效性。運(yùn)脾化濁顆粒與二甲雙胍在降低SREBP-1及LXR方面具有協(xié)同作用，而在降低PPARa方面優(yōu)勢(shì)不顯著。