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    半枝蓮提取物通過PI3K-Akt信號通路抑制胰腺癌模型大鼠腫瘤生長的機制研究

    2021-12-14 06:33:08袁文婷肖茂良
    陜西中醫(yī) 2021年12期
    關(guān)鍵詞:低濃度高濃度胰腺癌

    袁文婷,肖茂良,肖 鋒

    (湖南中醫(yī)藥高等??茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院 湖南省直中醫(yī)醫(yī)院,湖南 株洲412000)

    胰腺癌主要臨床表現(xiàn)為乏力、黃疸、食欲不振、腹部疼痛,具有早期診斷率低、惡性程度高、治療難度大、病死率高、預(yù)后差的特點,對患者身體健康及生命造成嚴(yán)重威脅[1-4]。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查顯示,近年來我國胰腺癌癥狀發(fā)病率呈現(xiàn)上升趨勢[5-6]。有研究表明,胰腺癌治療難度較大,西醫(yī)治療胰腺癌的療效并不理想,因此越來越多的專家學(xué)者致力于中醫(yī)藥治療胰腺癌的研究[7]。有研究證實,中藥提取物干預(yù)胰腺癌細胞能夠抑制其增殖,促進胰腺癌細胞凋亡,但是關(guān)于中藥提取物干預(yù)胰腺癌動物模型的研究鮮有報道[8-9]。本文采用半枝蓮提取物干預(yù)胰腺癌模型大鼠,觀察其對胰腺癌細胞、T淋巴細胞亞群、Wnt/β-catenin通路及PI3K-Akt信號通路蛋白的影響。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 實驗動物:SD健康雄性大鼠40只,由吉林大學(xué)動物實驗中心提供,年齡8~10個月,平均(9.0±0.8)個月;體重220~234 g,平均(226.9±4.7)g。在相對濕度50%~55%、溫度(24.1±2.1)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)大鼠1周,光照12 h/d。

    1.1.2 主要試劑:半枝蓮(亳州市億弘堂藥業(yè)有限公司);小鼠抗大鼠Wnt3α抗體(批號H20181002,Hyclone公司);兔抗大鼠β-catenin抗體(批號H20180901,Selleck公司);小鼠抗兔PI3K抗體(批號H20181101,Dako公司);兔抗小鼠Akt抗體(批號H20180801,BD公司);大鼠抗小鼠mTOR抗體(批號H20181001,Gibco公司);CD8+、CD4+、CD3+單克隆抗體(批號H20180302、H20180401、H20181001);PBS(批號H20181102);蛋白酶K(批號H20181001);平衡緩沖液(批號H20181201);SSC溶液(批號H20180701);TdT酶反應(yīng)液(批號H20180802);聚丙烯酰胺凝膠(批號H20181202)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 半枝蓮提取物制備:半枝蓮50 g粉碎得到半枝蓮粉,按照1∶20比例添加70%乙醇靜置24 h,70 ℃水浴處理4次,2 h/次,過濾,取濾液,按照1∶20比例向藥渣內(nèi)添加蒸餾水,加熱2 h,取濾液,合并2次所得濾液,按照1 g半枝蓮提取液=5.14 g半枝蓮生藥換算,添加0.9%的氯化鈉溶液配制不同濃度半枝蓮提取物溶液。

    1.2.2 建模、分組與給藥:隨機選取10只大鼠為正常組,不做任何處理。其余30只大鼠建立胰腺癌模型,方法如下:對大鼠進行麻醉后固定,于腹部正中做10 mm小切口,顯露出胰腺組織,將胰腺被膜及胰腺實質(zhì)切開1 mm,植入9 mg DMBA(批號H20180901)后縫合切口,消毒。30 d后大鼠皮下出現(xiàn)1 cm左右結(jié)節(jié)為胰腺癌建模成功。30只大鼠共建模成功24只,隨機分為模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組各8只。正常組、模型組大鼠予0.9%的氯化鈉溶液灌胃處理,低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠分別使用20、60 mg/kg半枝蓮提取物溶液灌胃處理,每組均連續(xù)干預(yù)14 d,1次/d。

    1.2.3 標(biāo)本的采集與處理:所有大鼠干預(yù)結(jié)束后,取尾部靜脈血2 ml,2000 r/min離心處理15 min后分離上清液,在-80 ℃環(huán)境中保存待檢。采用斷頭法處死大鼠,分離胰腺組織,測量胰腺腫瘤組織體積、重量后將其固定于4%甲醛溶液24 h。

    1.2.4 組織病理學(xué)檢測:將標(biāo)本于甲醛溶液內(nèi)固定后予常規(guī)石蠟包埋并切片,切片烤干后脫蠟,順序置入不同濃度梯度酒精中各復(fù)水3 min,蘇木精染色15 min后清洗3次,鹽酸酒精分化處理30 s,充分清洗后予1%伊紅染色,酒精脫水,脫蠟,封片后顯微鏡下觀察。

    1.2.5 T淋巴細胞亞群檢測:待測標(biāo)本予抗凝處理后分為兩管,分別加入20 μl的CD8+、CD4+、CD3+單克隆抗體,室溫環(huán)境下孵育30 min后在各管內(nèi)加入融血劑,待其完全溶血后離心,3000 r/min,離心5 min,棄上清液,洗滌液洗滌后在各管內(nèi)加入150 μl固定劑,加入0.5 ml的PBS混合均勻制備為懸液,采用流式細胞儀檢測CD8+、CD4+、CD3+水平。

    1.2.6 TUNEL法檢測細胞凋亡:細胞常溫下予20 μg/ml蛋白酶K培養(yǎng)0.5 h后去除蛋白,清洗后加入100 μl平衡緩沖液,室內(nèi)平衡10 min,滴入100 μl的TdT酶反應(yīng)液,避光、室溫孵育1 h后加入100 μl的SSC溶液,靜置20 min后清洗3次,DAPI復(fù)染,避光培養(yǎng)10 min后清洗、封片觀察。DAPI復(fù)染細胞核呈藍色,凋亡細胞細胞核呈綠色,取每切片3個視野進行觀察,計算細胞凋亡率。

    1.2.7 蛋白印跡法檢測Wnt3α、β-catenin、PI3K、Akt、mTOR相對表達量:取Ripa裂解液,PMSF冰中孵育30 min,1500 r/min,離心15 min,取上清。每個樣品取15 g蛋白,聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)入PDVF膜,5%脫脂牛奶常溫密封2 h,加入抗體過夜孵育,TBST液沖洗,加入二抗,60 min后清洗、顯色,計算Wnt3α、β-catenin、PI3K、Akt、mTOR相對表達量。

    2 結(jié) 果

    2.1 各組大鼠胰腺組織形態(tài)學(xué)比較 正常組大鼠胰腺組織細胞排列整齊,大小一致,界限清晰,細胞核均勻;模型組大鼠胰腺組織細胞細胞排列較為雜亂,且伴有嚴(yán)重炎癥細胞浸潤現(xiàn)象;高濃度半枝蓮組大鼠胰腺組織細胞排列較為整齊,大小相對一致,炎癥細胞浸潤現(xiàn)象明顯緩解(圖1)。

    圖1 各組大鼠胰腺組織形態(tài)圖(HE染色,×400)

    2.2 各組大鼠腫瘤組織體積、重量比較 見表1。與模型組比較,低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠腫瘤組織體積小、重量均輕,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與低濃度半枝蓮組比較,高濃度半枝蓮組大鼠腫瘤組織體積小、重量均輕,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表1 各組大鼠腫瘤組織體積、重量比較

    2.3 各組大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平比較 見表2。與正常組大鼠比較,模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠CD8+水平較高,CD4+、CD3+水平較均低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠CD8+水平較低,CD4+、CD3+水平均較高,且高濃度半枝蓮組大鼠CD8+水平低于低濃度半枝蓮組,CD4+、CD3+水平均高于低濃度半枝蓮組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表2 各組大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平比較(%)

    2.4 各組大鼠腫瘤組織細胞凋亡率比較 低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠細胞凋亡率分別為(16.59±2.13)%、(25.71±2.96)%,均高于模型組(2.98±0.39)%的細胞凋亡率,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且高濃度半枝蓮組大鼠細胞凋亡率高于低濃度半枝蓮組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    2.5 各組大鼠Wnt3α、β-catenin相對表達量比較 見表3。與正常組大鼠比較,模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠Wnt3α、β-catenin相對表達量均較高,且低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠Wnt3α、β-catenin相對表達量均低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與低濃度半枝蓮組比較,高濃度半枝蓮組大鼠Wnt3α、β-catenin相對表達量均較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表3 各組大鼠Wnt3α、β-catenin相對表達量比較

    2.6 各組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對表達量比較 見表4。與正常組比較,模型組、低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對表達量均較高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且低濃度半枝蓮組、高濃度半枝蓮組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對表達量均低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);與低濃度半枝蓮組比較,高濃度半枝蓮組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對表達量均較低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表4 各組大鼠PI3K、Akt、mTOR相對表達量比較

    3 討 論

    胰腺癌作為臨床上惡性程度極高的腫瘤,5年生存率低于5%,其發(fā)病原因及發(fā)病機制尚未闡明[10-11]。西醫(yī)抗腫瘤藥物具有較多的不良反應(yīng),中醫(yī)藥治療惡性腫瘤則具有細胞毒性小的優(yōu)勢[12]。半枝蓮有悠久的藥用歷史,具有化瘀、解毒、清熱、調(diào)節(jié)免疫等功效。有研究表示,半枝蓮能夠誘導(dǎo)細胞凋亡、自噬,抑制細胞增殖、轉(zhuǎn)移,具有一定的抗腫瘤作用[13-14]。本研究顯示,半枝蓮提取物干預(yù)的胰腺癌大鼠腫瘤組織體積減小、重量減輕,且隨半枝蓮提取物濃度升高,腫瘤組織體積、重量下降幅度越大,說明半枝蓮提取對胰腺癌組織的生長具有一定的抑制作用,且呈濃度依賴性,其原因可能是半枝蓮提取物能夠有效促進胰腺癌大鼠癌細胞凋亡,抑制癌組織的生長。胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與細胞增殖、凋亡關(guān)系密切,其可促進胰腺癌細胞凋亡,抑制胰腺癌細胞增殖,抑制進一步擴散[15-17]。本研究對胰腺癌大鼠癌細胞凋亡檢測結(jié)果顯示,半枝蓮提取物干預(yù)胰腺癌模型后,胰腺癌細胞凋亡率明顯上升。說明半枝蓮提取物具有促進胰腺癌組織細胞凋亡的作用,且呈濃度依賴性。

    胰腺癌的發(fā)生發(fā)展與機體免疫功能水平密切相關(guān),調(diào)節(jié)胰腺癌患者免疫功能是治療及改善其預(yù)后的關(guān)鍵[18]。T淋巴細胞亞群是評價機體細胞免疫功能的指標(biāo),本文研究結(jié)果顯示,與正常大鼠比較,胰腺癌模型大鼠T淋巴細胞亞群CD8+、CD4+、CD3+水平明顯異常,半枝蓮提取物干預(yù)的胰腺癌大鼠CD8+、CD4+、CD3+水平明顯改善,且隨半枝蓮提取物濃度升高,CD8+、CD4+、CD3+水平改善更明顯,說明胰腺癌可導(dǎo)致機體免疫功能異常,半枝蓮提取物具有調(diào)節(jié)免疫的作用,且呈濃度依賴性。

    Wnt/β-catenin通路參與癌細胞分化、自噬等生物學(xué)行為,Wnt3α、β-catenin是Wnt/β-catenin通路的主要配體,二者表達的變化與細胞自噬、凋亡密切相關(guān)[19-20]。本研究結(jié)果顯示,胰腺癌模型大鼠癌組織Wnt3α、β-catenin表達異常升高,半枝蓮提取干預(yù)后胰腺癌大鼠癌組織Wnt3α、β-catenin表達明顯下調(diào),隨半枝蓮提取物濃度升高,Wnt3α、β-catenin表達下調(diào)更顯著,說明半枝蓮提取物干預(yù)胰腺癌模型大鼠,能夠通過Wnt/β-catenin通路調(diào)控胰腺癌細胞分化、自噬能力,從而抑制胰腺癌進展。PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白P13K、Akt、mTOR表達變化與細胞凋亡能力密切相關(guān),參與胰腺癌的發(fā)病[21-22]。本研究結(jié)果顯示,胰腺癌模型大鼠癌組織P13K、Akt、mTOR異常高表達,半枝蓮提取物干預(yù)的胰腺癌大鼠癌組織P13K、Akt、mTOR蛋白表達明顯下調(diào),隨半枝蓮提取物濃度的升高,P13K、Akt、mTOR表達下調(diào)更顯著,說明半枝蓮提取物干預(yù)胰腺癌模型大鼠通過調(diào)控PI3K-Akt信號通路,促進胰腺癌細胞凋亡,抑制胰腺癌進展。

    綜上所述,半枝蓮提取物可抑制胰腺癌模型大鼠腫瘤組織,調(diào)控胰腺癌大鼠T淋巴細胞亞群水平,調(diào)控Wnt/β-catenin通路及PI3K-Akt信號通路相關(guān)蛋白表達,促進胰腺癌細胞自噬、凋亡。

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