連術(shù)消渴顆粒對2型糖尿病模型大鼠腸道菌群、腸黏膜屏障功能及水通道蛋白的影響

李慧敏,李鵬輝,吉蘭潔,閆 鏞

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450046；2.開封市中醫(yī)院，河南 開封 475000)

2型糖尿病(Type 2 diabetes，T2DM)是常見的內(nèi)分泌疾病，預(yù)計2045年，全球T2DM患者將達(dá)到6.29億[1]。T2DM發(fā)病率高，發(fā)病機制復(fù)雜，易引起腸道菌群變化及腸道相關(guān)并發(fā)癥，腸道菌群的變化亦可影響T2DM的發(fā)生和發(fā)展[2-3]。糖尿病患者易并發(fā)腹瀉，其機制可能與外周血高糖引發(fā)腸黏膜屏障損傷及水通道蛋白表達(dá)異常有關(guān)[4-5]。連術(shù)消渴顆粒是閆鏞教授治療T2DM的經(jīng)驗方，臨床證實其治療T2DM療效較好[6]。本研究擬通過腹腔注射鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)制備T2DM大鼠模型，觀察連術(shù)消渴顆粒對T2DM模型大鼠糖代謝、腸道菌群、腸黏膜屏障功能及結(jié)腸水通道蛋白的影響，從多重角度初步闡釋連術(shù)消渴顆粒干預(yù)T2DM的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：60只健康SPF級SD雄性大鼠購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，體重200～220 g，動物合格證號1107261911004137、生產(chǎn)許可證號SCXK(魯)20190003、實驗室使用許可證編號SYXK(豫)2015-0005，于22 ℃、50%濕度條件下飼養(yǎng)。

1.1.2 實驗藥物：連術(shù)消渴顆粒由黃連、澤瀉、山楂各30 g，蒼術(shù)、枳實、制半夏、陳皮各10 g，升麻、干姜、甘草各6 g，茯苓20 g，水蛭3 g，大棗3枚組成，由廣東一方制藥有限公司制成顆粒劑。

1.1.3 實驗試劑與儀器：STZ(批號LF20191009，北京六一生物科技公司)；D-乳酸(D-lactic acid，D-LA)、連蛋白(Zonulin)ELISA 試劑盒(批號WHB647235、WHB647305，美國Cloud-Clone Corp公司)；乳脂球表皮生長因子-8(Milk fat globule EGF factor-8，MFG-E8)(批號ab235638，英國Abcam科技公司)；水通道蛋白4(Aquaporin 4，AQP4)、水通道蛋白8(Aquaporin 8，AQP8)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，Gapdh)單克隆抗體(批號ab125049、ab133667，英國Abcam公司)；ChemDoc XRS型化學(xué)發(fā)光成像儀(美國Bio-rad公司)、703940型半干轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-rad公司)、1703539型垂直電泳儀(美國Bio-rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 建模、分組及給藥：60只SD大鼠隨機分為空白組、模型組、連術(shù)消渴顆粒低劑量組、連術(shù)消渴顆粒中劑量組、連術(shù)消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組，每組各10只?？瞻捉M正常喂養(yǎng)，其余各組大鼠喂養(yǎng)高脂高糖飼料，大鼠飼養(yǎng)30 d后禁食12 h，腹腔注射STZ，劑量為45 mg/kg，空白組大鼠腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。1周后，大鼠尾部少量取血，若空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)≥11.1 mmol/L，隨機血糖≥16.7 mmol/L提示2型糖尿病造模成功[6]。模型組、連術(shù)消渴顆粒低劑量組、連術(shù)消渴顆粒中劑量組、連術(shù)消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組最終分別成模8、8、9、8、9只。連術(shù)消渴顆粒低劑量組、連術(shù)消渴顆粒中劑量組、連術(shù)消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組大鼠分別給予連術(shù)消渴顆粒2.92、5.84、11.68 g/(kg·d)及鹽酸二甲雙胍片0.17 g/(kg·d)灌胃，空白組及模型組給予相同劑量的純凈水灌胃，各組大鼠均治療30 d。

1.2.2 糖代謝相關(guān)指標(biāo)檢測：采用江蘇魚躍血糖儀檢測各組大鼠血漿FBG水平，采用放射免疫分析法檢測各組大鼠空腹血清胰島素(Fasting serum lisulin，F(xiàn)INS)水平，并計算胰島素抵抗指數(shù)(Homeostasis model assessment for insulin resistance，HOMA-IR)。HOMA-IR=(FBG×FINS)/22.5。

1.2.3 腸道菌群檢測：治療30 d末取各組大鼠糞便0.2 g于無菌培養(yǎng)皿中，加入糞便體積10倍雙蒸水稀釋，充分震蕩后形成均質(zhì)化懸濁液，依次進(jìn)行10倍系列稀釋至10-7。不同稀釋度選擇需氧、厭氧培養(yǎng)基進(jìn)行菌群培養(yǎng)，培養(yǎng)條件參照文獻(xiàn)進(jìn)行，對各組菌落數(shù)統(tǒng)計[7]。每克糞便的細(xì)菌數(shù)=菌落數(shù)×10 n×40，結(jié)果以每克糞便中的細(xì)菌菌落數(shù)的對數(shù)值Log CFU/g表示。

1.2.4 腸黏膜屏障功能檢測：抽取各組大鼠外周血，2000 r/min條件下分離血清，采用ELISA法檢測各組大鼠血清中D-LA、Zonulin及MFG-E8含量，操作流程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.2.5 水通道蛋白檢測：取各組大鼠結(jié)腸組織并制備組織勻漿，應(yīng)用冷研磨法破壞組織，BCA法測定各樣本蛋白濃度。各組均取10 μl樣本液和5 μl蛋白Marker加入電泳裝置中，10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，待電泳結(jié)束后將含蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂奶粉常溫封閉4 h，加入AQP4一抗、AQP8一抗4 ℃封閉過夜，次日取出PVDF膜，PBS液洗膜3次，加入二抗后常溫下孵育2 h，取出PVDF膜，PBS液洗膜3次，ECL顯像，暗室曝光，掃描膠片，采用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析結(jié)果。實驗獨立重復(fù)3次。目標(biāo)蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白的灰度值/Gapdh的灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠糖代謝指標(biāo)比較 見表1。與空白組比較，模型組大鼠FINS降低，F(xiàn)BG、HOMA-IR水平均升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，連術(shù)消渴顆粒低劑量組、連術(shù)消渴顆粒中劑量組、連術(shù)消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組FINS水平均升高，F(xiàn)BG、HOMA-IR水平均降低，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表1 各組大鼠糖代謝指標(biāo)比較

2.2 各組大鼠腸道菌群比較 見表2。與空白組比較，模型組大鼠糞便培養(yǎng)中大腸桿菌數(shù)量增加，雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；與模型組比較，連術(shù)消渴顆粒低劑量組、連術(shù)消渴顆粒中劑量組、連術(shù)消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組大鼠糞便培養(yǎng)中大腸桿菌數(shù)量降低，雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量增加，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表2 各組大鼠腸道菌群比較(Log CFU/g)

2.3 各組大鼠腸黏膜屏障功能標(biāo)記物比較 見表3。與空白組比較，模型組大鼠血清腸黏膜屏障功能標(biāo)記物D-LA、Zonulin含量升高，MFG-E8含量降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與模型組比較，連術(shù)消渴顆粒低劑量組、連術(shù)消渴顆粒中劑量組、連術(shù)消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組大鼠血清中D-LA、Zonulin含量降低，MFG-E8含量升高，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。

表3 各組大鼠腸黏膜屏障功能標(biāo)記物比較

2.4 各組大鼠結(jié)腸水通道蛋白表達(dá)比較 見表4(圖1)。與空白組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中AQP4、AQP8表達(dá)均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與模型組比較，連術(shù)消渴顆粒低劑量組、連術(shù)消渴顆粒中劑量組、連術(shù)消渴顆粒高劑量組及二甲雙胍組AQP4、AQP8表達(dá)均升高，且呈劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表4 各組大鼠結(jié)腸組織中AQP4、AQP8表達(dá)比較

A：空白組；B：模型組；C：連術(shù)消渴顆粒低劑量組；D：連術(shù)消渴顆粒中劑量組；E:連術(shù)消渴顆粒高劑量組;F：二甲雙胍組

3 討 論

糖尿病屬于中醫(yī)“消渴”范疇，由近代醫(yī)家張錫純首次明確“消渴”即糖尿病。糖尿病有虛實燥熱之別，主要病機為脾胃受損、升降運化失司、濕熱瘀結(jié)所致，治療方面立足于中焦脾胃，立法為運脾清熱，瀉濁化瘀，重鑄中焦運化，方可改善機體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，濡養(yǎng)五臟六腑，輸布百骸精微。連術(shù)消渴顆粒是閆鏞教授治療T2DM的經(jīng)驗方，其組成是在“升降散”“黃連溫膽湯”治療消渴病的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗化裁而來，全方由黃連、蒼術(shù)、枳實、升麻、制半夏、陳皮、茯苓、澤瀉、山楂、水蛭、干姜、大棗、甘草組成，共成運脾、宣導(dǎo)、清熱、升陽、通瘀之法，標(biāo)本兼顧，則脾運、濁化、瘀消，三焦、經(jīng)絡(luò)通暢，消渴自除[8]。

腸道菌群數(shù)量龐大，約有500～1000種類型，其數(shù)量是人體自身細(xì)胞的10倍之多，可與宿主以物質(zhì)的形式進(jìn)行信息交流及物質(zhì)交換，是人體后天獲得的“器官”，參與宿主的生長、生活、營養(yǎng)、代謝和疾病發(fā)展過程[9-13]。腸道菌群可通過結(jié)構(gòu)變化影響宿主對營養(yǎng)的需求及情緒變化，導(dǎo)致體重、糖脂代謝、膽汁酸鹽代謝紊亂及免疫失衡，參與T2DM的發(fā)病[14]。已有研究證實中藥復(fù)方可通過調(diào)節(jié)腸道菌群，對T2DM起到一定的治療作用[15]。本團隊通過腹腔注射STZ建立經(jīng)典T2DM大鼠模型，發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠腸道菌群中大腸桿菌數(shù)量增加，雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量降低，整體腸道菌群結(jié)構(gòu)變化，這與張海平等[16]研究結(jié)果相似。通過不同劑量連術(shù)消渴顆粒進(jìn)行干預(yù)治療后，大鼠糖代謝功能改善，F(xiàn)INS升高，F(xiàn)BG及HOMA-IR均降低，糞便培養(yǎng)大腸桿菌數(shù)量降低，雙歧桿菌及乳酸桿菌數(shù)量增加，呈劑量依賴性，并且高劑量組上述指標(biāo)改善后水平與空白組相近，說明高劑量連術(shù)消渴顆粒治療T2DM效果較好，可基本改善大鼠血糖升高及胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，其機制可能與改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，增強微生物對糖分酵解作用并調(diào)節(jié)腸道對糖分吸收功能有關(guān)。

腸黏膜屏障功能與糖尿病的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，二者互為因果，高糖可破壞腸黏膜完整性，而腸黏膜屏障完整性被破壞導(dǎo)致小腸絨毛性水腫，影響降糖藥物吸收，從而導(dǎo)致血糖升高[17-18]。D-LA、Zonulin及MFG-E8是目前公認(rèn)的腸黏膜屏障功能血清標(biāo)志物，雖然三者產(chǎn)生機制不同，但均可準(zhǔn)確反映腸黏膜屏障功能狀態(tài)[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠存在腸黏膜屏障功能損傷，血清D-LA、Zonulin含量升高，MFG-E8含量降低，經(jīng)連術(shù)消渴顆粒治療后，D-LA、Zonulin及MFG-E8水平均得到改善，說明連術(shù)消渴顆粒的降糖效果可能與修復(fù)腸黏膜屏障功能有關(guān)。因此推測連術(shù)消渴顆粒對T2DM大鼠腸黏膜屏障功的改善可能是中藥對腸黏膜的直接作用，治療后增強了腸黏膜屏障的完整性；也可能是連術(shù)消渴顆粒調(diào)整T2DM大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)，減輕對腸黏膜屏障的破壞，有效阻滯腸內(nèi)微生物、內(nèi)毒素、有毒食物及食物抗原的入侵，從而改善大鼠自身胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，達(dá)到降糖目的。

《傷寒論·辨厥陰病脈證并治第十二》言：“厥陰之為病，消渴，氣上……下之利不止”，津液代謝紊亂是T2DM的特征之一。大腸與肺相表里，主津，是人體水液代謝的重要一環(huán)，大腸可吸收食物中的水分，行津液于上焦，清降肺火，又可灌溉肌膚，充實腠理。水通道蛋白是大腸、結(jié)腸對水液吸收的主要運載“工具”，既往對T2DM水通道蛋白的研究主要集中在心、肺、腎，結(jié)腸中水通道蛋白的報道較少[21]。AQP4、AQP8均在結(jié)腸中表達(dá)，其中AQP4是目前已知的水轉(zhuǎn)移能力最強的蛋白，高于其他水通道蛋白3～4倍，AQP8有獨特的水液重吸收功能[22-23]。本研究結(jié)果提示，T2DM大鼠結(jié)腸組織AQP4、AQP8表達(dá)均明顯降低，經(jīng)高劑量連術(shù)消渴顆粒治療后AQP4、AQP8表達(dá)均升高至正常水平。說明連術(shù)消渴顆?？筛纳芓2DM大鼠結(jié)腸水液代謝功能，一方面可能通過中藥復(fù)方直接起效，增加水通道蛋白表達(dá)，另一方面可能通過調(diào)節(jié)大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)、恢復(fù)腸黏膜屏障功能而降低血糖，從而對結(jié)腸水通道蛋白起到保護作用。

綜上所述，連術(shù)消渴顆?？筛纳芓2DM模型大鼠糖代謝，修復(fù)腸黏膜屏障功能，提高結(jié)腸水通道蛋白表達(dá)，其機制可能與改善腸道菌群有關(guān)。