消化道腫瘤患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及血清VEGF水平聯(lián)合檢測的臨床意義

沙 敏，欒正云

（泰州市人民醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300）

近年來隨著生活方式和環(huán)境的變化，惡性腫瘤發(fā)病率不斷上升，已成為威脅生命健康的重要疾病。隨著對消化道惡性腫瘤的深入研究與分析，臨床資料指出消化道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)、腫瘤血管形成等密切相關(guān)[1]。同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤浸潤T 淋巴細(xì)胞可表達(dá)一種于腫瘤生長所需的血管生成調(diào)節(jié)因子VEGF，表明T細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[2]。本研究通過聯(lián)合檢測消化道腫瘤患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及血清VEGF水平，探討兩者在消化道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等臨床價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對象選取2019 年1 月至2020 年1 月期間至泰州市人民醫(yī)院就診、經(jīng)醫(yī)院病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)診斷的消化道腫瘤患者共146例，其中男76例，女70 例；平均年齡（56.1±10.6） 歲；腫瘤類型:結(jié)直腸癌54 例，胃癌31 例，肝癌30 例，食管癌19 例，胰腺癌12 例；臨床TNM 分期:Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ期74 例，Ⅳ期38 例；病理分級：高分化（I 級） 28 例，中分化（II 級） 51 例，低分化（III級） 67 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有腫瘤患者均經(jīng)醫(yī)院病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)確診。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有其他消化道疾病患者；有糖尿病、心臟病等其他基礎(chǔ)疾病患者；伴有其他類型惡性腫瘤患者；有全身免疫系統(tǒng)疾病者。對照組為35名健康體檢者，平均年齡（47.95±8.23） 歲，對照組所有腫瘤指標(biāo)均正常。不同腫瘤類型患者與健康對照組在性別和年齡方面無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 外周血T淋巴細(xì)胞亞群的檢測 人CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PercP/CD4-APC 流式抗體（100TEST）購于北京同生時(shí)代有限公司。外周血T 淋巴細(xì)胞亞群檢測采用流式細(xì)胞術(shù)。所有腫瘤患者均于前一晚20 點(diǎn)后禁食禁水，次日清晨空腹抽取靜脈血，進(jìn)行常規(guī)EDTA 抗凝處理，健康對照組收集當(dāng)天體檢血常規(guī)剩余標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)步驟：（1） 標(biāo)記流式管，編號對應(yīng)相應(yīng)患者號；（2） 加入人CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PercP/CD4-APC 的熒光抗體20ul 至流式管底部；（3） 上下顛倒血標(biāo)本，混勻后向流式管中加入全血100ul；（4） 渦旋震蕩5s，讓抗體和標(biāo)本充分混勻，28℃條件下避光染色20分鐘；（5） 加入紅細(xì)胞裂解液1ml，渦旋震蕩10s，進(jìn)行充分裂解紅細(xì)胞， 28℃條件下避光放置10分鐘；（6） 離心，1500r/min 條件下，5 分鐘，棄上清；（7） 洗滌細(xì)胞，用1ml 生理鹽水重懸細(xì)胞，混勻后1500r/min 離心5 分鐘，棄上清；（8） 加入1ml 生理鹽水重懸細(xì)胞為單細(xì)胞懸液，BD FASCCalibur 流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD3+、CD8+T細(xì)胞亞群，并計(jì)算CD4+/ CD8+的值。

1.2.2 血清VEGF的檢測 人VEGF ELISA 試劑盒（96 人份/盒） 購于北京健平金星生物科技有限公司。所有血液標(biāo)本為肝素抗凝靜脈血3ml，4℃離心，3000 r/min，15分鐘后，吸取上清液分裝，置于-80℃冰箱冷凍備測。VEGF 的檢測原理為雙抗體夾心法，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒的說明進(jìn)行。以VEGF ＞142pg/ml 為界限，判斷為VEGF陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)采用“xˉ±s” 表示，組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同類型消化道腫瘤患者外周血T 細(xì)胞亞群的比較流式細(xì)胞檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，消化道惡性腫瘤（結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、食管癌和胰腺癌） 患者CD3+、CD4+T 細(xì)胞亞群比例以及CD4+/ CD8+比值明顯降低（P＜0.05），而CD8+T細(xì)胞亞群比例明顯高于對照組（P＜0.05，見表1）。

表1 不同類型消化道腫瘤患者外周血T細(xì)胞亞群的比較

2.2 不同類型消化道腫瘤患者外周血T 細(xì)胞亞群與腫瘤臨床生物學(xué)行為的關(guān)系臨床分期中，消化道惡性腫瘤患者CD3+和CD4+T 細(xì)胞亞群比例以及CD4+/ CD8+比值在I～I(xiàn)I 期時(shí)較高，在III 期含量明顯降低（P＜0.05），在IV期達(dá)到最低（P＜0.05）；而CD8+T 細(xì)胞亞群比例在I～I(xiàn)I 期時(shí)較低，在IIIIV期明顯升高（P＜0.05）。在病理分級中，消化道腫瘤患者CD4+和CD3+T 細(xì)胞亞群比例以及CD4+/CD8+比值在I 級較高，在II-III 級時(shí)含量低（P＜0.05）；而CD8+T 細(xì)胞亞群在I 級時(shí)較低，在II-III級含量明顯升高（P＜0.05，見表2）。

表2 消化道腫瘤患者外周血T細(xì)胞亞群與腫瘤臨床生物學(xué)行為的關(guān)系

2.3 不同類型消化道腫瘤患者血清VEGF 水平比較消化道惡性腫瘤患者血清VEGF 水平升高非常明顯，與對照組相比，結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、食管癌、胰腺癌患者血清VEGF 升高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

表3 不同類型消化道腫瘤患者血清VEGF水平比較

2.4 消化道腫瘤患者血清VEGF與腫瘤臨床生物學(xué)行為的關(guān)系臨床分期中，消化道腫瘤患者血清VEGF在I～I(xiàn)I期時(shí)含量較低，在III期含量明顯升高（P＜0.05），在IV期達(dá)到最高（P＜0.05）；在病理分級中，消化道腫瘤患者血清VEGF在I級和II級時(shí)含量較低（P＜0.05），在III級時(shí)達(dá)到最高（P＜0.05，見表4）。

表4 消化道腫瘤患者血清VEGF含量與腫瘤臨床生物學(xué)行為的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、食管癌和胰腺癌是臨床上常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，占我國惡性腫瘤一半左右，且發(fā)病率和病死率都很高。研究表明，消化道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。當(dāng)宿主的免疫功能低下或缺陷時(shí)，消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生率增高，而在惡性腫瘤進(jìn)展時(shí)，患者的細(xì)胞免疫功能亦會受到抑制。消化道惡性腫瘤進(jìn)展與機(jī)體免疫力低下之間互為因果[2]。

T淋巴細(xì)胞是人體關(guān)鍵性的免疫細(xì)胞，T細(xì)胞依據(jù)其細(xì)胞表面分子標(biāo)志物的不同分為不同的亞群，在抗腫瘤免疫中分別起不同的作用。CD3+T細(xì)胞是免疫細(xì)胞的功能基礎(chǔ)，CD4+T 細(xì)胞存在誘導(dǎo)以及輔助功能，CD8+T 細(xì)胞則存在抑制與毒殺作用。已知CD8+T 細(xì)胞與CD4+T 細(xì)胞作用相反，具有抑制B細(xì)胞生成抗體、阻止T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)細(xì)胞及抑制細(xì)胞、體液免疫的作用，因此CD4+/CD8+亦是反應(yīng)機(jī)體免疫狀態(tài)的指標(biāo)[3]。在正常狀態(tài)下，CD4+/ CD8+比值維持動態(tài)平衡，以保持機(jī)體免疫功能穩(wěn)定，腫瘤患者此比值明顯下降，且惡性度越高此比值越低[4]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，消化道惡性腫瘤患者CD4+和CD3+T 細(xì)胞亞群明顯降低而CD8+T細(xì)胞亞群明顯升高。CD4+/ CD8+比值在健康對照組為1.5左右，而消化道惡性腫瘤均小于0.5，尤其是惡性度高的胰腺癌患者此比值只有0.3 左右。這些研究結(jié)果說明消化道惡性腫瘤患者細(xì)胞免疫功能下降，這也是此類腫瘤易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能機(jī)制之一。

消化道臨床分期及腫瘤的病理類型與預(yù)后有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，消化道惡性腫瘤患者的CD4+和CD3+T細(xì)胞亞群以及CD4+/ CD8+比值在較低臨床分期（I～I(xiàn)I 期） 和病理級別（I 級） 時(shí)較高，而在較高臨床分期（III 和IV 期） 和病理級別（II級和III 級） 時(shí)較低；而CD8+T 細(xì)胞亞群在較低臨床分期（I～I(xiàn)I期） 和病理級別（I級） 時(shí)較低，而在較高臨床分期（III 和IV 期） 和病理級別（II 級和III級） 時(shí)較高。這些研究結(jié)果進(jìn)一步說明，消化道惡性腫瘤患者惡性度越高細(xì)胞免疫功能越低，這與以前的報(bào)道相一致[5]。

腫瘤浸潤T 淋巴細(xì)胞可表達(dá)一種腫瘤生長所需的血管生成調(diào)節(jié)因子VEGF，表明T細(xì)胞介導(dǎo)的血管生成因子，如VEGF 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[2]。在血管生成與腫瘤的研究中，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF） 也是目前了解最為深入的血管生成家族，該家族成員對消化道惡性腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移具有重要影響。VEGF與受體結(jié)合后可引起鈣離子內(nèi)流，通過激活細(xì)胞內(nèi)信息傳遞對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生促分裂、增生和趨化的作用；同時(shí)增強(qiáng)血管通透性，有利于血漿、纖維蛋白外滲從而促進(jìn)血管形成。消化道惡性腫瘤組織血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，腫瘤間質(zhì)血管數(shù)的增多不僅使腫瘤生長加速、侵襲性增強(qiáng)、而且增加了轉(zhuǎn)移的機(jī)會，導(dǎo)致患者預(yù)后差[6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，消化道惡性腫瘤患者的血清VEGF 明顯升高，其值是健康對照者3 倍左右，這與牛小平等的研究結(jié)果相一致[7]。本組結(jié)果亦顯示消化道惡性腫瘤患者血清中的VEGF 含量與臨床分期及病理分級密切相關(guān)，其含量分別在臨床分期IV期和病理分級III級時(shí)到達(dá)最高（P＜0.01），表明患者血清中VEGF 含量均隨著臨床分期及病理分級的升高而逐漸增加。因此檢測腫瘤患者血清中的VEGF 含量，可對消化道腫瘤患者的診斷起到一定的輔助作用。

綜上所述，檢測消化道惡性腫瘤患者外周血T 淋巴細(xì)胞亞群來監(jiān)測患者的免疫狀態(tài)，可為消化道惡性腫瘤患者的免疫輔助治療提供有效依據(jù)。同時(shí)，檢測血清VEGF 對消化道惡性腫瘤的早期診斷以及病情進(jìn)展的判斷具有一定的參考價(jià)值。有研究證實(shí)，VEGF能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分化，這是腫瘤免疫缺陷的可能機(jī)制之一[8]。因此本研究聯(lián)合檢測消化道腫瘤患者外周血T 淋巴細(xì)胞亞群和血清VEGF 水平，為判斷腫瘤生長狀態(tài)和免疫輔助治療提供可能的依據(jù)。