西地那非對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓中Notch- 1/Jagged- 1通路的影響研究

向貽佳 蔡昌宏 吳勇輝 葉士勇 趙歡 曾春來

肺動脈高壓是一種以肺動脈壓力升高、右心室肥厚及右心衰竭為特征的惡性血管疾病[1]。目前認(rèn)為肺血管重塑在肺動脈高壓病理發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，其病理過程涉及肺小動脈內(nèi)膜纖維化、中膜肥厚以及管腔狹窄[2-3]。其中Notch 信號通路在肺動脈重塑過程中起著重要作用[4-5]。研究已經(jīng)證實西地那非能通過抑制磷酸二酯酶、發(fā)揮內(nèi)皮保護(hù)作用等改善肺動脈高壓[6-8]?；贜otch 信號通路及西地那非在肺動脈平滑肌細(xì)胞重塑中的作用，本文探討西地那非對野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動脈高壓血管重塑過程中Notch-1/Jagged-1 信號通路的影響，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和試劑 選擇雄性SD 大鼠（年齡6～8 周，體重250～300 g）42 只，購于浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，飼養(yǎng)在無特定病原體級環(huán)境中，溫度（21±1）℃，濕度（55±5）%，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食及飲用水。野百合堿（C2401） 購自美國Sigma 公司，Notch-1 抗體（ab52627） 購自英國Abcam 公司、Hes-1 抗體（ab71559） 購自英國Abcam 公司、Jagged-1 抗體（ab7771） 購自英國Abcam 公司、α-SMA 抗體（ab5694） 購自英國Abcam 公司、GAPDH 抗體（5174S）購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 動物造模及給藥 42 只大鼠采用隨機數(shù)字表法分成3 組，模型組16 只、西地那非組16 只及對照組10 只。模型組及西地那非組大鼠一次性背部皮下注射野百合堿溶液60 mg/kg 建立肺動脈高壓模型，對照組背部皮下注射0.8 mL 0.9%氯化鈉注射液。造模3 周后西地那非組予西地那非100 mg·kg-1·d-1灌胃，連續(xù)2 周，每周測體重1 次，根據(jù)大鼠體重調(diào)整西地那非用量（100mg·kg-1·d-1）。西地那非給藥期間，模型組及對照組予等體積0.9%氯化鈉注射液灌胃。

1.2.2 右心室收縮壓（right ventricular systolic pressure，RVSP）及右心肥厚指數(shù)（right ventricular hypertrophy index，RI）測定 至給藥第5 周末，存活大鼠用4%水合氯醛麻醉后固定，剪去頸部毛發(fā)，依次切開皮膚、皮下組織，分離右側(cè)頸外靜脈，結(jié)扎遠(yuǎn)心端，采用右心導(dǎo)管法，Medlab 生物信號記錄儀記錄RVSP。測壓結(jié)束后，自右心室導(dǎo)管注入10%氯化鉀溶液處死動物，分離心臟及肺。剪去心房，分離右心室和左心室+ 室間隔，分別稱重，計算RI。RI= 右心室質(zhì)量/（左心室質(zhì)量+ 室間隔質(zhì)量）。右肺置于4%多聚甲醛中固定，其余肺立即置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 肺組織肺小動脈病理檢查 右肺組織在4%多聚甲醛中固定72 h 后，取右肺上葉組織經(jīng)過不同濃度乙醇脫水、二甲苯透明及石蠟包埋，切成3～5 μm薄片。采用HE 和Masson 染色方法觀察肺小動脈形態(tài)及纖維化情況。

1.2.4 Notch-1、Hes-1、Jagged-1 及α-SMA 表達(dá)水平的檢測 取冰凍的肺組織100 mg （每組6 個樣本），以冰PBS 漂洗3 次，剪成細(xì)小的碎片，按每20 mg 組織加入150～250 μL 裂解液的比例，加入含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的組織細(xì)胞快速裂解液，采用勻漿器勻漿直至肺組織完全裂解。將裂解后的樣品以4 ℃12 000 g 離心15 min，取上清液，用蛋白定量法進(jìn)行蛋白質(zhì)定量后貯存于-80 ℃冰箱。經(jīng)過配膠（10%分離膠分離膠+ 濃縮膠）、上樣（每孔蛋白80 μg）、電泳、轉(zhuǎn)膜、化學(xué)發(fā)光檢測靶蛋白條帶，軟件分析灰度值，與內(nèi)參GAPDH 比較，得出靶蛋白Notch-1、Hes-1、Jagged-1 及α-SMA 相對含量。

1.2.5 肺小動脈中α-SMA 表達(dá)水平的檢測 石蠟切片通過脫蠟、水化及PBS 漂洗后，隨后進(jìn)行抗原修復(fù)與阻斷，孵育α-SMA 抗體及二抗，蘇木素復(fù)染，清洗，脫水及封片。光學(xué)顯微鏡下觀察肺小動脈染色情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用Graph Pad Prism（vision 7.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Tukey 檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組大鼠RVSP 及RI 比較 第5 周末，模型組、西地那非組及對照組存活大鼠分別為8、10、8只。3 組大鼠RVSP 及RI 比較見表1。

由表1 可見，模型組RVSP 和RI 均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。西地那非組RVSP 和RI 均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 3 組大鼠RVSP 及RI 比較

2.2 3 組大鼠肺小動脈病理檢查結(jié)果比較 見圖2（見封三）。

由圖2 可見，HE 及Masson 染色顯示，與對照組比較，模型組肺小動脈明顯增厚、纖維化增加。西地那非組肺小動脈結(jié)構(gòu)異常較模型組改善。

2.3 3 組大鼠肺組織中靶蛋白Notch-1、Hes-1 以及Jagged-1 表達(dá)比較 見圖3。

由圖3 可見，模型組Notch-1、Hes-1 及Jagged-1表達(dá)水平均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。西地那非組Notch-1、Hes-1 及Jagged-1表達(dá)水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

圖3 3 組大鼠肺組織中靶蛋白Notch-1，Hes-1 以及Jagged-1 表達(dá)比較（A：3 組大鼠Notch-1、GAPDH 蛋白電泳圖及Notch-1/GAPDH 柱狀圖；B：3 組大鼠Hes-1、GAPDH 蛋白電泳圖及Hes-1/GAPDH 柱狀圖；C：3 組大鼠Jagged-1、GAPDH 蛋白電泳圖及Jagged-1/GAPDH 柱狀圖；*P＜0.05，**P＜0.01）

2.4 3 組大鼠肺小動脈α-SMA 蛋白表達(dá)比較 見圖4（見封三）。

由圖4 可見，模型組α-SMA 表達(dá)水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。西地那非組α-SMA 表達(dá)水平低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 3組大鼠肺小動脈α-SMA 蛋白表達(dá)比較（A：3 組大鼠肺小動脈α-SMA 免疫組化，×400；B：3 組大鼠α-SMA、GAPDH 蛋白電泳圖；C：3 組大鼠α-SMA/GAPDH 柱狀圖；**P＜0.01）

3 討論

肺動脈高壓是一種嚴(yán)重的惡性血管疾病，本研究采用皮下注射野百合堿溶液建立肺動脈高壓模型。本研究結(jié)果表明，野百合堿注射5 周后RVSP 及RI 明顯升高，提示成功建立野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型。西地那非干預(yù)后，RVSP 及RI 明顯下降，說明西地那非可改善肺動脈高壓，研究結(jié)果與其他研究結(jié)果一致[9-12]。本研究還觀察發(fā)現(xiàn)，建模后肺小動脈明顯增厚、纖維化增加，而西地那非干預(yù)后上述表現(xiàn)得到改善。

目前已知肺血管重塑在肺動脈高壓形成過程中起著關(guān)鍵作用，涉及細(xì)胞肥厚、增殖、遷移、凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)沉積等病理改變。多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與血管重塑。近年來，研究發(fā)現(xiàn)Notch 信號通路在細(xì)胞凋亡及血管重構(gòu)中起著重要作用[13-16]，且Notch 信號通路也參與了肺動脈高壓形成病理過程[17-19]。Notch信號通路包括4 種受體（Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4） 和5 種 跨膜 配 體（Jagged-1、Jagged-2、Delta-like 1、Delta-like 2、Delta-like 3）[20-21]。研究表明，Notch 受體1、3 和4 以及配體Dll4、Jagged-1 和Jagged-2 在動脈系統(tǒng)中高度表達(dá)，對維持正常血管結(jié)構(gòu)、凋亡及血管重構(gòu)起著重要作用[16]。受體胞外區(qū)和相鄰細(xì)胞上的配體結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象改變，暴露蛋白水解酶切位點，Notch 胞內(nèi)段經(jīng)分解酶水解進(jìn)入細(xì)胞核并與重組信號結(jié)合蛋白J 結(jié)合調(diào)節(jié)下游靶基因（Hes/Hey，ERBB2，Id 等），從而發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓模型Notch-1、Jagged-1 及Hes1 蛋白表達(dá)明顯增加，西地那非可抑制上述蛋白的表達(dá)。此外，血管平滑肌中α-SMA 表達(dá)水平在肺動脈高壓模型中明顯升高，而西地那非干預(yù)后可抑制其表達(dá)。 本研究進(jìn)一步證實Notch-1/Jagged-1 信號通路參與野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓形成過程，而西地那非能夠抑制野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓中Notch-1/Jagged-1 信號通路。

綜上所述，Notch-1/Jagged-1 信號通路在野百合堿誘導(dǎo)的肺動脈高壓中活化，而西地那非能夠抑制肺動脈高壓中Notch-1/Jagged-1 信號通路，為西地那非用于治療包括肺動脈高壓在內(nèi)的血管重構(gòu)性疾病提供了實驗基礎(chǔ)。但本研究存在不足之處，西地那非是否通過Notch-1/Jagged-1 信號通路直接作用于肺動脈平滑肌細(xì)胞，從而抑制肺動脈重構(gòu)仍有待進(jìn)一步體內(nèi)外實驗證實。