酶解工藝及美拉德反應溫度優(yōu)化制備煙草花蕾香料

白家峰，梁德全，王宣靜，劉紹華，許春平

（1.廣西中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，南寧530001；2.廣西真龍實業(yè)有限責任公司技術中心，廣西鐘山542600；3.鄭州輕工業(yè)大學食品與生物工程學院，鄭州450000）

煙草打頂抹杈可以促進根系和葉片的生長，減少養(yǎng)分的消耗，同時減輕病蟲害。因此，煙草在種植過程中除留種煙株外，都必須在適當時期對其打頂，即將花蕾及其以下葉片摘除［1］。煙草花蕾是煙草的一部分，也含豐富的香氣成分，是天然的植物香料之一，經(jīng)提取可以作為很好的煙草香精香料［2-5］。前人對煙草花蕾的報道中，孫福山等［6］采用葉花同烤與常規(guī)烘烤2種烘烤方法，比較烤后煙葉經(jīng)濟性狀、外觀質量、感官質量、常規(guī)化學成分含量和致香物質含量，結果顯示葉花同烤有增加烤后煙葉致香物質的作用。劉齊元等［7］對煙草雄性不育系和相應的保持系花蕾內源激素含量比值進行分析比較，探討煙草雄性不育性發(fā)生的內在原因，結果表明不育系花蕾中幾種內源激素的平衡關系出現(xiàn)了異常，這可能與雄性不育有關。而對以酶解花蕾為原料進行美拉德反應制備煙用香料的研究不多，本研究通過酶解技術結合美拉德反應增香制備煙用香料，旨在優(yōu)化煙草花蕾酶解工藝條件和美拉德反應溫度，給卷煙制香條件提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

主要材料與試劑：云煙87煙草花蕾；葡萄糖、谷氨酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、3，5-二硝基水楊酸鈉、丙二醇、NaOH、H2SO4、二氯甲烷、乙酸苯乙酯均為分析純。

主要儀器與設備：Q-100A3旗箭粉碎機，上海冰都電器有限公司；HS-4恒溫水浴鍋，上海醫(yī)療器械股份有限公司醫(yī)療器械五廠；PL203電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；RIGOL UItra-3400紫外分光光度計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DGX-9143電熱恒溫鼓風干燥箱，上海福瑪實驗設備有限公司；BIORIDGE盧湘儀，鄭州科技玻璃儀器廠；TGL-16M離心機，鄭州科技玻璃儀器廠；同時蒸餾萃取裝置，鄭州科技玻璃儀器廠；6890/5973氣相色譜/質譜聯(lián)用儀，安捷倫科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料的預處理將干燥的云煙87煙草花蕾粉碎，過60目篩，置干燥鍋中備用。

1.2.2 單因素試驗方法在料液比1∶10的酶解條件下，分別研究加酶量、酶解時間、pH和酶解溫度對氨基酸和還原糖含量的影響。

1）加酶量對氨基酸和還原糖含量的影響：在酶解時間4 h、酶解溫度50℃、pH 7的條件下，加酶量分別設定為1.0%、1.5%、2.0%、2.5%。

2）酶解時間對氨基酸和還原糖含量的影響：在加酶量1.5%、酶解溫度50℃、pH 7的條件下，酶解時間分別設定為4、5、6、7 h。

3）pH對氨基酸和還原糖含量的影響：在加酶量1.5%、酶解溫度50℃、酶解時間5 h的條件下，pH分別設定為6、7、8、9。

4）酶解溫度對氨基酸和還原糖含量的影響：在加酶量1.5%、酶解時間5 h、pH 7的條件下，酶解溫度分別設定為30、40、50、60℃。

1.2.3 美拉德反應處理方法在單因素酶解最優(yōu)的條件下做4個溫度梯度的美拉德反應，4個樣品中各加入20 mL丙二醇，調pH至7，用封口膜封口，分別放入溫度為50、60、70、80℃的油浴鍋中，反應12 h。

1.2.4 同時蒸餾萃取方法［8-11］將美拉德反應產(chǎn)物倒入同時蒸餾萃取裝置一端的平底燒瓶中，加入100 mL去離子水，用電子調溫電熱套加熱，裝置的另一端蒸餾瓶中注入50 mL二氯甲烷，于60℃水浴中加熱。當水與二氯甲烷分層便開始計時，2.5 h后萃取結束，在二氯甲烷萃取液中加入濃度為0.822 1 mol/mL的乙酸苯乙酯1 mL和無水硫酸鈉若干，靜置過夜。然后于35~40℃條件下濃縮，濃縮至1 mL轉移至樣品瓶中，低溫密封保存，用于GC-MS進行定量分析。

1.2.5 GC-MS條件色譜條件［12］：色譜柱為HP-5MS色譜柱（30 m×250 μm×0.25 μm），進樣口溫度280℃，分流比10∶1，進樣量1 μL，載氣為氦氣，載氣流量3 mL/min，升溫程序：初起始溫度50℃，以4℃/min升至280℃；質譜條件：EI源，接口溫度270℃，電子能量70 eV，四極桿溫度150℃，采集模式為掃描，質量掃描范圍為35~550m/z。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗分析結果

2.1.1 加酶量對還原糖和氨基酸含量的影響由圖1可知，還原糖含量隨加酶量的增加變化幅度較小，在加酶量為1.5%時含量最高，氨基酸含量隨加酶量的增加先升后降，在加酶量為1.5%時氨基酸含量最高，因此選擇1.5%為最適加酶量。

圖1 加酶量對還原糖和氨基酸含量的影響

2.1.2 酶解時間對還原糖和氨基酸含量的影響由圖2可知，還原糖和氨基酸含量均隨酶解時間的加長呈先升后降的趨勢，在酶解時間為5 h時還原糖和氨基酸含量均達到最大值，因此選擇5 h為最適酶解時間。

圖2 酶解時間對還原糖和氨基酸含量的影響

2.1.3 酶解pH對還原糖和氨基酸含量的影響由

圖3 酶解pH對還原糖和氨基酸含量的影響

2.1.4 酶解溫度對還原糖和氨基酸含量的影響由圖4可知，還原糖和氨基酸含量隨溫度的增加均呈現(xiàn)先增后降的趨勢，在酶解溫度為50℃時還原糖和氨基酸含量均達到最大值，因此選擇50℃為最適酶解溫度。

圖4 酶解溫度對還原糖和氨基酸含量的影響

2.2 香味成分物質分析

在最優(yōu)的酶解條件下進行4個溫度梯度的美拉德反應，經(jīng)同時蒸餾萃取提取香味物質并進行GCMS分析。由表1可知，煙草花蕾酶解后經(jīng)過美拉德反應和同時蒸餾萃取提取，提取的香味物質在美拉德反應為50℃時有45種，60℃時有48種，70℃有47種，80℃時有43種，主要包括醇、醛、酸、酯、酮、萜烯類，其他還有酚、酰胺、呋喃、吲哚、吡啶、腈等。從煙堿含量來看，美拉德反應溫度為50℃時含量最高，但4個溫度梯度對煙堿含量的影響很小，最大值與最小值之間相差甚微；從香氣成分總量來看，美拉德反應溫度為60℃時含量最高，高達497.85 μg/g，香氣成分總量由高到低依次是美拉德反應溫度為60、70、80、50℃時，因此，煙草花蕾酶解后經(jīng)美拉德反應溫度在60℃時增香香氣含量最多，50℃時增香香氣含量最少。其中軟脂酸、肉豆蔻酸、苯乙醛、三環(huán)烯等香味物質含量高，二氫獼猴桃內酯、大馬士酮、油酸酰胺、2-正戊基呋喃香氣閾值低，是煙草中關鍵的致香物質，對煙草香氣貢獻突出。

表1 不同溫度下美拉德反應提取的香味物質含量

3 小結

本研究以煙草花蕾為原料，通過酶解工藝及美拉德反應溫度優(yōu)化來制備煙草花蕾香料，得到煙草花蕾酶解的最優(yōu)條件為酶解溫度50℃、pH 7、酶解時間5 h、加酶量1.5%；經(jīng)GC-MS分析香味成分，美拉德反應60℃時香味物質總量最高且種類最多，高達48種香氣成分，主要包括醇、醛、酸、酯、酮、呋喃和吡啶等；其中軟脂酸、肉豆蔻酸、苯乙醇、苯甲醇、苯乙醛、三環(huán)稀等香味物質含量高，二氫獼猴桃內酯、大馬士酮、油酸酰胺、2-正戊基呋喃香氣閾值低，是煙草中關鍵的致香物質，對煙草香氣貢獻突出。通過將廢棄煙草花蕾經(jīng)過酶解處理和美拉德反應增香后得到含有致香物質的香料，可以成為煙草香料的物料來源，為卷煙的實際生產(chǎn)提供新方向。

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