基因編輯技術(shù)在水稻抗病基因與育種研究中的應(yīng)用進(jìn)展

譚曉菁，王忠華，吳月燕，鄭二松，徐如夢(mèng)，陳劍平，王栩鳴，*，嚴(yán)成其，3，*

(1.浙江萬(wàn)里學(xué)院，浙江 寧波 315100； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險(xiǎn)防控國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021； 3.寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 寧波 315100)

水稻是世界上重要的糧食作物之一，全球超過(guò)30億人每天食用水稻[1]，大約7 000年前我國(guó)長(zhǎng)江流域就已經(jīng)開(kāi)始種植[2]。我國(guó)有廣大人口以水稻為主食，其固著生長(zhǎng)的模式難以避免病蟲(chóng)害的侵襲，病害如白葉枯菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae，Xoo)、稻瘟菌(Magnaportheoryzae)、紋枯菌(Rhizoctoniasolani)等；蟲(chóng)害如二化螟、卷葉螟、褐飛虱、灰飛虱、白背飛虱等，均給水稻生產(chǎn)帶來(lái)了嚴(yán)重危害[3]。目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的主要手段是通過(guò)農(nóng)藥來(lái)防治病蟲(chóng)害，但農(nóng)藥的長(zhǎng)期使用不僅會(huì)污染環(huán)境，還會(huì)造成谷物品質(zhì)的下降，同時(shí)農(nóng)藥的不當(dāng)使用還可能導(dǎo)致有害生物的抗藥性增強(qiáng)、病蟲(chóng)害加劇[4]。植物的抗病反應(yīng)受到多種信號(hào)通路的調(diào)控，其中包括正向調(diào)控和負(fù)向調(diào)控，因此可以考慮通過(guò)基因編輯手段敲除部分負(fù)調(diào)控植物抗病反應(yīng)的基因來(lái)提高植物的抗病性。

近年來(lái)，快速發(fā)展的基因編輯技術(shù)為克服上述矛盾開(kāi)辟了新道路。主要包括鋅指核酸酶(zinc finger nuclease，ZFN)[5]，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)[6]，CRISPR/Cas系統(tǒng)(clustered regularly interspaced short palindromicrepeats/CRISPR-associated protein，CRISPR/Cas)[7]、單堿基編輯系統(tǒng)(base editing，BE)和引導(dǎo)編輯系統(tǒng)(prime editing，PE)[8]。利用基因編輯技術(shù)可使目的基因發(fā)生定向突變，從而獲得具有目標(biāo)性狀的突變材料，其效率遠(yuǎn)超通過(guò)自發(fā)突變、化學(xué)誘變、物理輻射等其他突變方式，基因編輯技術(shù)能有效地避免連鎖累贅效應(yīng)，為各物種的基因編輯研究提供了前所未有的便利，因而引起世界研究人員的廣泛關(guān)注[9]。

1 基因編輯技術(shù)概述

孟德?tīng)柕认闰?qū)的研究很好地展示了傳統(tǒng)遺傳學(xué)研究依賴于自發(fā)突變的發(fā)現(xiàn)和分析這一特點(diǎn)。Muller和Auerbach證明了通過(guò)輻射或化學(xué)處理可以提高誘變效率[10-11]，但這些操作在基因組中產(chǎn)生的并不是定向突變，直至20世紀(jì)后期，科學(xué)家們才成功完成了第一批靶向基因組突變[12-15]。基因編輯實(shí)質(zhì)是在特定基因位點(diǎn)利用序列特異性核酸酶(sequence specific nucleases，SSN)打斷染色體DNA，隨后借助編輯受體自身的DNA修復(fù)系統(tǒng)在非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)過(guò)程中隨機(jī)產(chǎn)生DNA片段的插入或缺失(small insertions and deletions，INDELs)或在同源重組連接(homologous recombination，HR)過(guò)程中隨機(jī)產(chǎn)生的INDELs，最終導(dǎo)致基因序列的突變[16]。

1.1 ZFN基因編輯技術(shù)

鋅指結(jié)構(gòu)是很早就被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)的一類能與DNA互作的蛋白結(jié)構(gòu)基元。ZFN由鋅指蛋白構(gòu)成的DNA識(shí)別域和FokⅠ蛋白構(gòu)成的切割域組成，它可以打斷靶位點(diǎn)的染色體DNA[17-18]。ZFN根據(jù)其組成鋅指蛋白基元的種類及排列方式的不同來(lái)識(shí)別各種DNA序列[19]，其編輯效率受核酸酶的DNA親和力影響。該技術(shù)已被成功應(yīng)用于多種動(dòng)植物體的基因編輯，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中也顯示出極大的應(yīng)用價(jià)值，在作物研究中也有典型的成功案例，如EXZACT Precision Technology已成功在小麥、玉米、大豆和棉花等主要作物物種完成精確突變并產(chǎn)生新穎且理想的表型[20]。

1.2 TALEN基因編輯技術(shù)

基于對(duì)TAL效應(yīng)因子(TAL effector，TALE)的研究，科研人員發(fā)現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶。TAL效應(yīng)因子最初是在黃單胞菌分泌的效應(yīng)蛋白中被發(fā)現(xiàn)的，該病原體的效應(yīng)蛋白成功侵染植物細(xì)胞質(zhì)后，通過(guò)靶定效應(yīng)因子特異性的基因啟動(dòng)子來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，從而影響植物的代謝過(guò)程，使其對(duì)病原物變得更加易感。TALEs酶可分為三部分：N段為信號(hào)生成結(jié)構(gòu)域，中間為脫氧核糖核苷酸結(jié)合域，C端為核定位信號(hào)和啟動(dòng)結(jié)構(gòu)域[21]?？蒲腥藛T利用TALE具有序列特異性結(jié)合的特點(diǎn)將FokⅠ核酸內(nèi)切酶與一段人造的TALE連接起來(lái)，形成一類兼具TALE和FokⅠ內(nèi)切酶特性的強(qiáng)大工具，稱為TALEN。該技術(shù)已被應(yīng)用于動(dòng)物、植物、微生物甚至人類自身的基因組編輯[22]。

1.3 CRISPR基因編輯技術(shù)

1987年，CRISPR基因座首次被鑒定為一組29 bp的串聯(lián)重復(fù)序列，在大腸埃希菌中以 32 bp的DNA序列間隔排列[23]。后來(lái)，Mojica等[24]發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、古細(xì)菌及同源性較高的原核生物均具有結(jié)構(gòu)相似且高度保守的重復(fù)序列。通過(guò)對(duì)古細(xì)菌和細(xì)菌基因組進(jìn)行分析，將這類重復(fù)序列定義為CRISPR。數(shù)年后，CRISPR/Cas系統(tǒng)的生物學(xué)意義才被證實(shí)：CRISPR是原核生物基因組內(nèi)的一段重復(fù)序列，包括一系列與之功能相關(guān)的蛋白[25]，并在原核生物對(duì)病毒感染的免疫過(guò)程中發(fā)揮作用[26]。同時(shí)根據(jù)編程酶的不同分為CRISPR/Cas系統(tǒng)和CRISPR/Cpf系統(tǒng)。

1.3.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

CRISPR/Cas系統(tǒng)由CRISPR序列元件和Cas家族組成，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三種類型。三種類型的系統(tǒng)都具有識(shí)別和切割與crRNA互補(bǔ)的核苷酸序列的特性。其中CRISPR/Cas9是目前報(bào)道最強(qiáng)大的基因編輯工具，是唯一被優(yōu)先應(yīng)用于基因編輯的Ⅱ型系統(tǒng)[27]。該系統(tǒng)能夠在植物基因組特定位點(diǎn)產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，通過(guò)NHEJ機(jī)制在修復(fù)目標(biāo)基因的過(guò)程中引入DNA片段插入或缺失，從而產(chǎn)生定向突變。CRISPR/Cas9及其優(yōu)化版本在動(dòng)物、植物、微生物中均有相關(guān)應(yīng)用[28-31]，同時(shí)在農(nóng)作物的生產(chǎn)改良方面成果顯著[32]，但Cas9蛋白特異性識(shí)別原間隔序列臨近基序(protospaceradjacent motif，PAM)的特性限制其靶向性，影響了編輯效率和靈活性，一定程度上限制了它們?cè)诨蚪M編輯中的效率。

最新研究報(bào)道Walton團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種名為SpG的化膿鏈球菌Cas9變體，該變體幾乎完全消除了PAM的限制，能夠靶向更廣泛的NGN PAM[33]。在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后Walton團(tuán)隊(duì)還開(kāi)發(fā)出變體SpRY，兩種新型Cas9變體讓研究人員獲得了與疾病相關(guān)的全新的遺傳變異基因。新的實(shí)驗(yàn)突破性地實(shí)現(xiàn)了高精準(zhǔn)靶向編輯，這為未來(lái)進(jìn)一步深入探究物種基因功能提供了前沿技術(shù)支持。

1.3.2 CRISPR/Cpf系統(tǒng)

來(lái)源于CRISPR系統(tǒng)的3種Cpf1核酸內(nèi)切酶AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1，都可用于水稻基因編輯[34-38]。CRISPR/Cpf1系統(tǒng)對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)起到了適當(dāng)補(bǔ)充作用，前者為后者不能編輯的區(qū)域提供新的目標(biāo)位點(diǎn)，使基因組可編輯區(qū)域進(jìn)一步擴(kuò)大；同時(shí)Cpf1識(shí)別靶位點(diǎn)只需一段較短的crRNA與CPF1蛋白，不需tracrRNA存在[39]。與Cas9不同，Cpf1自身能加工前體crRNA，這種利用加工crRNA的特異性靶向和切割目的DNA的能力可以進(jìn)一步簡(jiǎn)化多重基因組編輯，提高編輯效率。總而言之，CRISPR/Cpf1系統(tǒng)的使用拓寬了基因組編輯的范圍，擴(kuò)展了農(nóng)業(yè)研究的深度。

1.3.3 單堿基編輯系統(tǒng)

單堿基編輯技術(shù)是基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)發(fā)展起來(lái)的新型靶基因修飾技術(shù)，其編輯系統(tǒng)不包切割活性的Cas蛋白(deactivated Cas， dCas)，或只有一條包含融合切割活性的Cas蛋白(nickase Cas， nCas)與脫氨酶的鏈來(lái)實(shí)現(xiàn)靶位點(diǎn)處堿基的定點(diǎn)替換。依據(jù)不同堿基修飾酶可以分為嘧啶堿基編輯器(cytosine base editor， CBE)和嘌呤堿基編輯器(adenine base editor， ABE)[40]。CBE一般由胞嘧啶脫氨酶(APOBEC1)、nCas9或dCas9蛋白組成；而ABE工具則多是利用定向進(jìn)化的腺嘌呤脫氨酶TadA融合nCas9蛋白構(gòu)成。這兩類堿基編輯系統(tǒng)利用CBE或ABE對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)的脫氨基反應(yīng)，最終經(jīng)DNA復(fù)制修復(fù)后，可以分別實(shí)現(xiàn)C-T(G-A)或A-G(T-C)的堿基替換[41]。較前幾代基因編輯技術(shù)，BE編輯效率更高，脫靶率更低，靈敏度更高，更適應(yīng)探索物種基因功能的現(xiàn)代研究。

首先，改進(jìn)進(jìn)度管理模式能夠促進(jìn)建筑工程整體質(zhì)量的提升。在現(xiàn)代建筑工程施工過(guò)程中，涉及到的內(nèi)容十分復(fù)雜，加之工程周期較緊，想要在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)保質(zhì)保量的完成施工作業(yè)，必須做好進(jìn)度管理工作。因此進(jìn)度管理作為工程管理的一個(gè)方面，其所占的地位越來(lái)越重要。工程進(jìn)度的順利推進(jìn)，不僅關(guān)系著工程成本，和工程質(zhì)量也存在緊密聯(lián)系，因此對(duì)進(jìn)度管理模式進(jìn)行改進(jìn)可以為建筑工程整體質(zhì)量的提升提供一定的推動(dòng)作用。在具體施工中，建筑工程管理標(biāo)準(zhǔn)和要求若是得不到有效的落實(shí)，必然會(huì)對(duì)工程進(jìn)度產(chǎn)生一定的影響，甚至威脅到建筑工程的使用壽命。

1.3.4 引導(dǎo)編輯系統(tǒng)

2019年10月，Anzalone等[42]報(bào)道了不同于堿基編輯的基因組精確編輯技術(shù)，即引導(dǎo)編輯系統(tǒng)(prime editing)。該系統(tǒng)將活性部分缺失的Cas9內(nèi)切酶(nSpCas9)和工程化改造的逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV RT)融合，直接將新的遺傳信息寫入指定的DNA位點(diǎn)。其實(shí)質(zhì)是由pegRNA(primeediting guide RNA)中g(shù)uide RNA靶定基因位點(diǎn)并由nCas9切割形成編輯鏈上的單鏈切口，進(jìn)而通過(guò)pegRNA中的PBS(primer binding site)序列引導(dǎo)將含有目標(biāo)編輯序列的逆轉(zhuǎn)錄模板將突變精確導(dǎo)入到基因組中。該實(shí)驗(yàn)組對(duì)人類細(xì)胞中進(jìn)行了上百次的編輯，包括靶向插入，缺失和12種類型的點(diǎn)突變，實(shí)驗(yàn)不依賴雙鏈斷裂或供體DNA模板。目前以植物偏好密碼子優(yōu)化而來(lái)的植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)已被成功運(yùn)用至水稻和小麥的DNA精確編輯中。

綜上所述，不同基因編輯技術(shù)各有其優(yōu)勢(shì)和局限之處，如ZFN技術(shù)的編輯效率相較于同源重組有了較大提高，但鋅指表達(dá)文庫(kù)構(gòu)建復(fù)雜，后續(xù)篩選工作量龐大，且在ZFN剪切突變DNA形成同源二聚體的同時(shí)，可能會(huì)產(chǎn)生異源二聚體形成脫靶效應(yīng)，造成DNA的錯(cuò)配和序列改變，產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，甚至引起細(xì)胞凋亡[43]；TALEN較一代基因編輯技術(shù)在成本、細(xì)胞毒性和脫靶率上有所降低，實(shí)驗(yàn)效率及特異性有所提高，但模塊組裝過(guò)程較為繁瑣[44]。目前已有多種發(fā)展成熟的方法進(jìn)行合成TALEN，如GOLDEN GATE組裝法、基于長(zhǎng)黏末端的LTC組裝法、快速高通量固相合成法等；而CRISPR/Cas9系統(tǒng)較上述編輯技術(shù)又有了較大提升，該系統(tǒng)無(wú)需重新構(gòu)建Cas蛋白，就能進(jìn)行單個(gè)基因的多位點(diǎn)編輯，極大地簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，降低成本，有力地推進(jìn)了生物工程和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，但在植物細(xì)胞中，由于同源重組頻率偏低和DNA供體遞送困難，其同源介導(dǎo)修復(fù)(homology-directedrepair，HDR)效率顯著受限，難以實(shí)現(xiàn)高效的基因組精確編輯[45]；而在CRISPR/Cas9基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)的單堿基編輯技術(shù)，是新近發(fā)展的不依賴于HDR而介導(dǎo)的新型基因編輯技術(shù)，相比于之前的技術(shù)其編輯效率和靈敏度更高，脫靶率更低，但現(xiàn)有的堿基編輯器僅能完成特定的4種形式的堿基轉(zhuǎn)換，缺乏完成精確可控的堿基轉(zhuǎn)換或者片段插入缺失等其他基因組編輯的能力，但瑕不掩瑜，在多種植物中，CBE和ABE均可有效介導(dǎo)G-C-to-A-T的堿基轉(zhuǎn)換，為植物基因組精確編輯提供了新的可行策略。此外，引導(dǎo)編輯技術(shù)更是對(duì)單堿基編輯技術(shù)的又一創(chuàng)新突破，它可完成12種任意類型的堿基替換，高效編輯PAM遠(yuǎn)端序列的多個(gè)位點(diǎn)，且編輯效率更高。CRISPR/Cas9和單堿基編輯技術(shù)彼此優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，這也是兩者在近年來(lái)炙手可熱的重要原因。

除上述基因編輯技術(shù)外，還有許多傳統(tǒng)誘變技術(shù)和基于以上編輯技術(shù)加以創(chuàng)新突破的新的編輯方法，如反向遺傳方法、SGN(structure-guided nuclease)等，反向遺傳方法能通過(guò)定點(diǎn)突變某基因，研究其表型來(lái)確定該基因的功能，在作物改良計(jì)劃中作用顯著[46]。傳統(tǒng)誘變方法的簡(jiǎn)單性和可行性以擬南芥為代表的小基因組的二倍體植物的功能基因組學(xué)研究提供了更多的便利，但是獲得新品種需要較長(zhǎng)的周期且實(shí)驗(yàn)成功率較低?？偠灾黝惥庉嫾夹g(shù)都為功能基因組學(xué)的研究貢獻(xiàn)了新的實(shí)驗(yàn)思路[47]。

2 CRISPR/Cas9在水稻抗病基因研究中的應(yīng)用

基因編輯技術(shù)在醫(yī)藥，食品和工業(yè)生物技術(shù)方面應(yīng)用廣泛，在農(nóng)業(yè)應(yīng)用方面尤其是在水稻抗病育種中成果也十分顯著。關(guān)于利用基因編輯技術(shù)培育高抗水稻是關(guān)乎全球糧食安全的戰(zhàn)略性議題，具有重大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)學(xué)意義。其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)在培育抗病水稻品種，完成到2050年可能達(dá)到97億人口的龐大糧食需求問(wèn)題中發(fā)揮著巨大的作用[48]。下文是對(duì)該技術(shù)在近些年水稻抗病基因研究中的部分成果概述。

水稻東格魯病(rice tungro disease，RTD)是由水稻東格魯球形病毒(rice tungro spherical virus，RTSV)和水稻東格魯桿狀病毒(rice tungro bacilliform virus，RTBV)共同感染引起的。Macovei等[49]研究發(fā)現(xiàn)，水稻對(duì)RTD的抗性與翻譯起始因子4γ基因(eIF4G)緊密關(guān)聯(lián)，且eIF4G對(duì)植株正常發(fā)育至關(guān)重要。在利用CRISPR/Cas9產(chǎn)生突變后，RTSV易感品種也能獲得對(duì)RTD的抗性。研究發(fā)現(xiàn)，具有RTSV抗性的水稻株系在溫室條件下產(chǎn)量提高，且最終產(chǎn)物不再包含Cas9序列，該實(shí)驗(yàn)中培育的新型抗RTSV的eIF4G等位基因突變體水稻株系說(shuō)明選育多樣化的抗RTSV水稻品種具有高度可行性，這為研究抗RTD水稻提供了新的方案。

武廣珩等[50]利用CRISPR/Cas9成功創(chuàng)制了OsEDR1功能缺失突變體水稻株系。對(duì)其進(jìn)行白葉枯病接種實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，突變株系的病斑長(zhǎng)度比對(duì)照組減少約50%，對(duì)白葉枯病的抗性明顯增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，OsEDR1負(fù)調(diào)控水稻對(duì)白葉枯病原菌的抗病防御反應(yīng)且該反應(yīng)途徑可能與擬南芥所依賴的防御反應(yīng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路不同。同理，Ke等[51]、Liu等[52]利用CRISPR/Cas9技術(shù)分別敲除了基因OsEDS1和OsCUL3a，前者獲得了水稻白葉枯病易感株系，后者則增加了植株對(duì)白葉枯病的抗性，但Oscul3a的突變體材料中只有1個(gè)突變體是有這樣的表型，所以通過(guò)此技術(shù)獲得的突變體材料可能會(huì)因?yàn)榍贸奈稽c(diǎn)不同導(dǎo)致突變體材料之間產(chǎn)生差異，實(shí)驗(yàn)具有一定的偶然性，還需進(jìn)一步驗(yàn)證和改良以增加目標(biāo)性狀植株的突變頻率。以上實(shí)驗(yàn)為培育新型抗白葉枯病的水稻品系提供了新的基因資源，但同抗病基因OsEDR1、OsEDS1和OsCUL3a關(guān)聯(lián)的上下游基因與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還未明確，還需進(jìn)一步研究。

水稻基因組中存在大量抗病調(diào)控基因，如OsEDR1、OsEDS1、OsCUL3a、Ob-fold、Pi21、OsWAK112d等[56-57]。根據(jù)已有的研究結(jié)果猜測(cè)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)定向編輯這些抗病基因?qū)⒂兄谔嵘镜挚共『η趾Φ哪芰??？偠灾?，探究水稻抗病基因其?nèi)在的基因功能與外在的性狀表現(xiàn)，不僅有助于新型高質(zhì)高抗水稻基因資源的進(jìn)一步深入發(fā)掘，更是選育抗病新品種水稻的有效方法，具有重大的社會(huì)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。CRISPR/Cas9技術(shù)在水稻抗病基因研究方面發(fā)揮著巨大作用，也為探索其他動(dòng)植物基因功能的研究者們引領(lǐng)了方向。

3 CRISPR/Cas9在水稻抗病新品種選育中的應(yīng)用

稻瘟病是全世界影響水稻產(chǎn)量的毀滅性病害之一。相關(guān)研究表明，利用寄主抗性是控制稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。近年來(lái)，通過(guò)基因編輯技術(shù)改善作物性狀、提高作物產(chǎn)量已被廣泛認(rèn)可，其中CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)被認(rèn)為是提高水稻抗性和品質(zhì)的最為有效的方法。如Wang等[58]以水稻空育131為實(shí)驗(yàn)材料，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除其負(fù)調(diào)控稻瘟病抗性的類轉(zhuǎn)錄因子OsERF922，再通過(guò)農(nóng)桿菌侵染愈傷組織的方法成功獲得了抗稻瘟病株系。王芳權(quán)等[59]利用相同的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)與抗稻瘟病相關(guān)的Pi21基因的兩個(gè)靶位點(diǎn)進(jìn)行編輯，兩個(gè)靶位點(diǎn)突變效率均大于75%，鑒定發(fā)現(xiàn)突變株系均獲得稻瘟病抗性。2020年Nawaz課題組也通過(guò)CRISPR/Cas9靶向誘變來(lái)產(chǎn)生突變體，其在T0代獲得17株突變株，其中純合突變率為22%。研究表明，其純合突變體在不影響主要農(nóng)藝性狀的情況下，具有較強(qiáng)的抗稻瘟病能力[60]。這些結(jié)果揭示了基因組編輯的基本價(jià)值，同時(shí)也擴(kuò)大了學(xué)者們對(duì)水稻真菌侵染的認(rèn)識(shí)。

由水稻單黃胞菌致病變種Xoo引起的細(xì)菌性枯萎病是發(fā)生在亞洲水稻和非洲水稻中的重要病害，培育抗白葉枯病水稻品系是解決細(xì)菌性枯萎病最為有效的方案。水稻黃單胞菌致病變種Xoo分泌的轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物，可以結(jié)合特定的啟動(dòng)子序列從而誘導(dǎo)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)水稻的易感性[61]。CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯在3個(gè)蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因啟動(dòng)子中引入突變。田間實(shí)驗(yàn)顯示，3組SWEET突變均表現(xiàn)出顯著抗病性[62]。Zhou等[63]利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除SWEET13基因(SWEET家族基因)，成功獲得對(duì)米曲霉易感的突變株系。該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)SWEET基因在水稻抗病防衛(wèi)反應(yīng)起到重要的調(diào)控作用。這也提示我們反向思考該如何減少水稻細(xì)菌性侵害，激發(fā)水稻原本存在的隱性抗性基因表達(dá)可能成為一個(gè)可行的方案。

Hong等[64]利用CRISPR/Cas9技術(shù)將水稻品種ZH11中參與MAPK級(jí)聯(lián)反應(yīng)的OsMPK15基因敲除，從而獲得了對(duì)白葉枯病具有抗性的水稻植株。Osmpk15突變體較野生型的PR基因表達(dá)量升高，SA/JA的含量增加，活性氧含量上升，但是美中不足的是這個(gè)突變體的產(chǎn)量相比野生型有所下降。Yang等[65]研究表明，Os8N3是一個(gè)以Ⅲ型效應(yīng)器PthXo1為靶點(diǎn)的白葉枯病宿主易感基因。因此，Kim研究團(tuán)隊(duì)希望通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)敲除水稻Os8N3基因來(lái)研究水稻對(duì)白葉枯病的抗性，研究發(fā)現(xiàn)，純合突變體對(duì)白葉枯病原菌的抗性顯著增強(qiáng)，但在溫室生長(zhǎng)條件下，包括花粉發(fā)育、株高分蘗在內(nèi)的農(nóng)藝性狀在純合突變體與野生型之間并沒(méi)有顯著差異[66]。

綜上所述，CRISPR/Cas9技術(shù)在抗病新品種選育上起到了巨大作用，為研究水稻抗白葉枯病、抗稻瘟病、抗細(xì)菌性條斑病等提供了有力的技術(shù)支持，積攢了豐富的理論資源和實(shí)驗(yàn)素材。通過(guò)提高水稻抗病害能力以提高其產(chǎn)量是滿足全球糧食需求所必需的重要手段，CRISPR/Cas9技術(shù)為幾年后可能面臨的人口大量增長(zhǎng)而導(dǎo)致的全球糧食安全危機(jī)問(wèn)題提供了一個(gè)有效的解決方法。

4 前景與展望

基因編輯技術(shù)帶來(lái)的眾多便利將改變植物基礎(chǔ)研究和作物育種的面貌?；蚓庉嬁梢酝ㄟ^(guò)靶向突變來(lái)研究基因功能，通過(guò)形成新的基因突變體來(lái)發(fā)現(xiàn)新性狀，它還可以通過(guò)基因疊加簡(jiǎn)化并加速新性狀的引入和復(fù)雜性狀的保持。對(duì)生產(chǎn)部門而言，這意味著產(chǎn)品質(zhì)量更高，成本更低，勞動(dòng)力更少。對(duì)消費(fèi)者而言，這項(xiàng)新技術(shù)意味著將以更低的消費(fèi)獲得更多且更有營(yíng)養(yǎng)的食物。這同CRISPR/Cas9技術(shù)在改良水稻抗病性狀與分子育種方面所展露出的積極作用相同。因此，未來(lái)結(jié)合CRISPR/Cas9技術(shù)的新型抗病育種研究可能得到大量的應(yīng)用與推廣，從水稻上獲得的改良農(nóng)藝性狀的知識(shí)可以作為一個(gè)模型系統(tǒng)外推到其他谷類作物[67]，從而幫助我們更加有效、精準(zhǔn)、快速地培育優(yōu)質(zhì)抗病高產(chǎn)新作物。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)由于成本低廉、操作方便、效率高等優(yōu)點(diǎn)，迅速風(fēng)靡全球的實(shí)驗(yàn)室，成為了生物科研的有力幫手，并在多種植物中得到廣泛應(yīng)用，也為水稻抗病基因功能研究與作物遺傳性狀改良做出了重要貢獻(xiàn)。但研究人員也注意到該技術(shù)會(huì)產(chǎn)生非預(yù)期的效應(yīng)和未知變化等問(wèn)題，如果基因編輯產(chǎn)物比野生型更適應(yīng)環(huán)境，一旦群體進(jìn)入自然，可能會(huì)對(duì)其他物種產(chǎn)生影響。不過(guò)隨著科學(xué)研究不斷深入，相信該技術(shù)能夠更加安全、合理、廣泛地應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域。與此同時(shí)，還有更多的未知領(lǐng)域需要探索。目前基因編輯技術(shù)體系仍有諸多技術(shù)難題尚未解決，如發(fā)展更為高效精準(zhǔn)的基因編輯系統(tǒng)，推廣建立多重基因編輯體系[68]，優(yōu)化突變檢測(cè)技術(shù)等仍將是今后的努力方向。