生菜子多糖提取方法及其降血脂活性研究

楊豐榕，高建萍，李春燕

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010110）

0 引言

生菜子，菊科植物萵苣(Lactuca satyaL.)的干燥種子，又名黑苣勝，是蒙藥方劑中較常用的藥材之一。蒙醫(yī)理論中認(rèn)為其具有消食、調(diào)理胃火等功效，不僅可用于腹部鼓脹，面部浮腫等肝病，還可以治療嘔吐以及飲食后肝區(qū)疼痛等[1]。現(xiàn)代藥理研究后發(fā)現(xiàn)生菜子具有降血脂[2]、中樞抑制[3]、抗心律失常[4]等功效，但由于對(duì)生菜子的研究較少，其所含化學(xué)成分不明確，相關(guān)藥理活性的作用機(jī)制尚不清楚。

經(jīng)項(xiàng)目前期研究發(fā)現(xiàn)生菜子含有的主要化學(xué)成分之一為多糖，而多糖的多種藥理活性中包括降血脂[5]、降血糖[6-8]、抗氧化[9-11]等，其中多糖降血脂的機(jī)制包括直接降低體內(nèi)膽固醇、減少過氧化物生成等[12]，結(jié)合文獻(xiàn)中生菜子的降血脂作用，因此本文將生菜子多糖定為研究對(duì)象。

多糖的提取方法種類較多，有醇水法[13]、超聲法[14]、酶法[15]、微波法[16]等，其中最常用的還是醇水法，通過設(shè)計(jì)合理的正交試驗(yàn)得到最佳工藝。誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，簡(jiǎn)稱為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，是人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的機(jī)器學(xué)習(xí)方法[17-18]。本研究旨在將BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法與生菜子多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)合，利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法實(shí)現(xiàn)過程模擬，考察細(xì)微變化對(duì)提取結(jié)果的影響，進(jìn)而建立優(yōu)于正交試驗(yàn)的生菜子多糖的最佳提取方法，同時(shí)研究生菜子多糖結(jié)合膽酸鹽能力從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生菜子降血脂作用機(jī)制的初步研究，藉此實(shí)現(xiàn)對(duì)生菜子的深入研究并為多糖降血脂功效的研究提供部分理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生菜子，購自內(nèi)蒙古天力藥業(yè)，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室渠弼教授鑒定為菊科植物萵苣(Lactuca satyaL.)的干燥黑色種子。膽酸鈉、牛黃膽酸鈉、甘氨膽酸鈉（上海源葉試劑公司）、葡萄糖（040510 天津市化學(xué)試劑三廠），其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設(shè)備

752-型-紫外分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）、電子天平（AB135-S；METTLER TOLEDO，TA5003W，上海菁海儀器有限公司）、FZ-600型酸度計(jì)（成都世紀(jì)方舟科技公司）、旋蒸儀（N-1300D-WB）

1.3 方法

1.3.1 生菜子預(yù)處理 生菜子藥材經(jīng)粉碎后，先經(jīng)石油醚脫脂，再以95%乙醇除低聚糖，后將藥材粉末干燥備用。

1.3.2 生菜子多糖提取工藝 采用水醇法：預(yù)處理生菜子粉末+蒸餾水→煎煮→真空抽濾→濃縮→80%醇沉→得生菜子多糖，依據(jù)公式(1)計(jì)算多糖得率。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)采用的提取溫度分別選擇50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃，提取時(shí)間選擇0.5、1、1.5、2、2.5、3 h，提取次數(shù)選擇1、2、3、4次，溶劑倍量定為10、20、30、40、50、60倍，將以上4個(gè)因素作為生菜子多糖得率的主要影響因素進(jìn)行單因素考察實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 正交試驗(yàn) 以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)、溶劑倍量(D)為影響因素，以多糖得率作為指標(biāo)展開正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

1.3.5 基于正交設(shè)計(jì)的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化[19-21]以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中影響生菜子多糖得率的4 個(gè)主要因素作為4個(gè)輸入節(jié)點(diǎn)建立的B P 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸入層，以得率作為輸出節(jié)點(diǎn)建立輸出層，將綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用MAT LAB 7.0軟件實(shí)施編程，其中隱含層傳遞函數(shù)最終選擇tansig 雙曲正切傳遞函數(shù)，而輸出層傳遞函數(shù)則選擇purelin線性傳遞函數(shù)。

1.3.6 生菜子多糖體外結(jié)合膽酸實(shí)驗(yàn)

（1）樣品制備。取生菜子藥材粗粉，44倍蒸餾水，89℃提取1.6 h，提取4次，得生菜子多糖提取液。濃縮后，以60%乙醇、80%乙醇分級(jí)醇沉、90%乙醇直接醇沉，得到3 個(gè)樣品，分別為：60%醇沉生菜子多糖、80%醇沉生菜子多糖、生菜子粗多糖。

（2）膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[22]

步驟：（1）以磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L、pH 6.3)配制0.3 mmol/L 的?；悄懰徕c(STC)、甘氨膽酸鈉(SGC)和膽酸鈉(SC)溶液，備用；（2）分別取上述膽酸鹽溶液0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于10 mL 具塞試管中，以磷酸緩沖溶液補(bǔ)充至2.5 mL；（3）加入7.5 mL 硫酸溶液（質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%）；（4）70℃水浴20 min 冰浴5 min；（5）于387 nm處測(cè)定吸光度值；（6）以吸光度值和膽酸鹽濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)。取1 mL 的多糖溶液（粗多糖，60%醇沉，80%醇沉，分別配置成0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL）于10 mL 具塞試管中，加入1 mL HCl 溶液(0.01 mol/L)，37℃恒溫1 h，以NaOH溶液(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)pH 6.3，隨后加入4 mL 胰酶（10 mg/mL，pH 6.3 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制），于37℃恒溫震蕩1 h 后，每個(gè)樣品中分別再加入4 mL 不同的膽酸鹽溶液，于37℃恒溫振蕩1 h后，待膽酸鹽被充分結(jié)合后，4000 r/min，離心20 min。上清液按1.3.6.2項(xiàng)下方法測(cè)定膽酸鹽含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察結(jié)果

單因素考察結(jié)果見圖1～4。當(dāng)生菜子多糖的提取溫度為50℃～70℃時(shí)，多糖得率與溫度成正比，高溫促使多糖的溶出加速，但是當(dāng)溫度超過70℃時(shí)，高溫可能導(dǎo)致使多糖發(fā)生降解或者一定程度的糊化，從而使多糖的得率下降；當(dāng)提取時(shí)間為0.5～1.0 h 時(shí)，時(shí)間與多糖得率成正比，當(dāng)提取時(shí)間超過1.5 h 時(shí)，多糖的得率基本趨于穩(wěn)定；提取次數(shù)與多糖得率成正比，次數(shù)越多提取越充分，經(jīng)過提取3次后多糖得率則趨于平穩(wěn)；溶劑用量越多，多糖得率越高，但大量提取液需要濃縮，導(dǎo)致時(shí)間和能源的浪費(fèi)，因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)娜軇┍读俊?/p>

圖1 提取溫度對(duì)黑苣勝多糖提取率的影響

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)單因素考察結(jié)果建立正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，相關(guān)因素和水平及試驗(yàn)結(jié)果見表1～3。由表3可知，提取次數(shù)是生菜子多糖的提取工藝的主要影響因素，其余各個(gè)因素對(duì)生菜子多糖得率無顯著影響。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 生菜子多糖提取實(shí)驗(yàn)方差分析表

2.3 BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)所建立的BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)最大學(xué)習(xí)步長(zhǎng)為1000，目標(biāo)精度0.001，訓(xùn)練過程穩(wěn)定迅速，其穩(wěn)定性結(jié)果可見圖5～6。此網(wǎng)絡(luò)以正交試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)作為參考數(shù)據(jù)，模擬提取實(shí)驗(yàn)中未進(jìn)行的數(shù)據(jù)考察，可以由計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)1℃、1 倍水量、1 min 對(duì)生菜子多糖得率的影響，從而得到最優(yōu)結(jié)果。固定3個(gè)影響因素，仿真一個(gè)因素后所得的工藝為：89℃，44倍水，提取4次，1.6 h/次，結(jié)果見圖7～10。

圖2 提取時(shí)間對(duì)黑苣勝多糖提取率的影響

圖3 提取次數(shù)對(duì)黑苣勝多糖提取率的影響

圖4 溶劑的倍量對(duì)黑苣勝多糖提取率的影響

圖5 誤差收斂曲線

圖6 回歸相關(guān)性擬合曲線

圖7 針對(duì)提取溫度的仿真

圖8 針對(duì)提取時(shí)間的仿真

圖9 針對(duì)溶劑倍量的仿真

圖10 針對(duì)提取次數(shù)的仿真

2.4 生菜子多糖體外結(jié)合膽酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，生菜子粗多糖（粗）、60%醇沉(60%)、80%醇沉多糖(80%)對(duì)?；悄懰徕c(STC)、甘氨膽酸鈉(SGC)和膽酸鈉(SC)都有較好的結(jié)合率，并與多糖濃度在一定范圍內(nèi)呈正比。

表4 不同生菜子多糖對(duì)3種膽酸鹽的結(jié)合率

3 討論

通過本項(xiàng)目研究補(bǔ)充了目前針對(duì)生菜子這味藥食同源蒙藥的研究，發(fā)現(xiàn)了其所含主要化學(xué)成分是多糖，并對(duì)生菜子多糖的提取分離方法進(jìn)行了研究，填補(bǔ)了此味藥材在化學(xué)成分提取方法上的空白。由項(xiàng)目最終多糖得率可知采用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型所得的生菜子多糖提取工藝優(yōu)于正交試驗(yàn)，并且在不增加試驗(yàn)次數(shù)的基礎(chǔ)上就可以考察到更細(xì)微的條件變化，節(jié)約人力物力，僅利用少量數(shù)據(jù)即可通過計(jì)算機(jī)軟件分析各個(gè)影響提取的因素對(duì)生菜子多糖得率的影響規(guī)律，并找到最佳參數(shù)且此結(jié)果優(yōu)于正交試驗(yàn)結(jié)果，說明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法值得用于化學(xué)成分提取工藝的改進(jìn)。

本研究通過利用模擬腸胃條件的方法進(jìn)行了生菜子多糖膽酸鹽結(jié)合試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)多糖濃度高于2 mg/mL時(shí)，對(duì)膽酸鈉的結(jié)合率反而下降，可能是由于多糖分子比較大，當(dāng)濃度過高時(shí)，在空間上阻礙了其與膽酸鈉的結(jié)合，尚需結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

有學(xué)者認(rèn)為藥食同源的植物中功能性成分能夠于腸道結(jié)合內(nèi)膽酸鹽，部分可以通過影響脂類消化和吸收降血脂，還可以通過影響膽酸鹽的腸肝循環(huán)，使之排出體外，并促使膽固醇向膽酸鹽轉(zhuǎn)化來降低血脂[25-26]，結(jié)合本項(xiàng)目研究結(jié)果，可初步判斷生菜子降低血脂的藥理作用機(jī)制為生菜子多糖對(duì)膽酸鹽的結(jié)合作用，從而表明多糖是生菜子藥材降血脂效果的主要有效成分之一，能夠?yàn)橐院竺伤幧俗铀幚砘钚匝芯看蛳铝嘶A(chǔ)并指明將來的研究方向。

4 結(jié)論

正交試驗(yàn)作為常見的研究設(shè)計(jì)方法，不但經(jīng)濟(jì)、高效、快速，而且可以針對(duì)多因素多水平，局限是只能優(yōu)化研究者提供的多個(gè)水平的組合，而BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以學(xué)習(xí)規(guī)則，并實(shí)現(xiàn)自身訓(xùn)練，不僅能夠給定范圍尋優(yōu)，還能預(yù)測(cè)范圍中的最優(yōu)值，得到更加可靠，穩(wěn)定的結(jié)果[23-24]。

根據(jù)本項(xiàng)目?jī)?yōu)化得到的工藝平行進(jìn)行3次生菜子多糖的提取實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此工藝中多糖得率優(yōu)于正交試驗(yàn)結(jié)果，平均為11.17%，證明此最優(yōu)工藝穩(wěn)定并且可行，同時(shí)具有良好的重復(fù)性。

在生菜子多糖的膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，隨著3 種多糖的濃度增大，對(duì)牛黃膽酸鈉的吸附力增強(qiáng)，當(dāng)多糖濃度高于2 mg/mL 時(shí)，對(duì)其結(jié)合率基本穩(wěn)定。多糖濃度增加，對(duì)甘氨膽酸鈉的吸附能力呈正比，在多糖濃度為3 mg/mL 時(shí)達(dá)到吸附最大值，表明生菜子多糖可以重點(diǎn)吸附此類膽酸鹽。而3種多糖對(duì)膽酸鈉的吸附在多糖濃度為0.5～2 mg/mL時(shí)，逐步增加，但是當(dāng)多糖濃度高于2 mg/mL 時(shí)，對(duì)膽酸鈉的結(jié)合率反而下降。在3種多糖中，生菜子粗多糖對(duì)不同膽酸鹽的結(jié)合率最佳，其次是60%醇沉多糖，80%醇沉多糖。

本項(xiàng)目?jī)H從體外對(duì)生菜子多糖的降血脂作用進(jìn)行了研究，后期實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)生菜子多糖在高血脂動(dòng)物模型中的降血脂能力進(jìn)行研究。