潤(rùn)滑障礙中的lncRNA?mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建及功能預(yù)測(cè)

劉天嬌，張晶晶，馬潔樺，潘連軍，阮紅杰

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院婦女保健科，2產(chǎn)科，3醫(yī)學(xué)研究中心，4泌尿外科，5急診醫(yī)學(xué)科，江蘇 南京 210004

女性性功能障礙（female sexual dysfunction，F(xiàn)SD）是一種病因復(fù)雜的盆底功能障礙性疾病，受年齡、種族、月經(jīng)狀況、人際關(guān)系、心理健康等多重因素影響，嚴(yán)重影響夫妻關(guān)系的和諧［1-2］?！对\斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)：精神障礙》5版將FSD 分為：女性性欲?喚起障礙、女性性高潮障礙和性交痛障礙［3］。據(jù)估計(jì)，F(xiàn)SD的全球發(fā)生率為25.8%～91.0%［2］，而中國(guó)城市女性陰道潤(rùn)滑障礙（lubrication disorder，LD）、性高潮障礙、性喚起障礙、性欲低下以及性交痛的發(fā)生率分別為36.8%、30.6%、25.4%、23.6%和21.8%［4］，其中LD 為最常見(jiàn)類(lèi)型。雖然LD 的發(fā)生率如此之高，但受傳統(tǒng)文化的影響，女性羞于表達(dá)自己的煩惱和訴求，尤其是涉及性需求相關(guān)的問(wèn)題，這使得患有LD的女性在中國(guó)并沒(méi)有受到足夠的重視［5］。因此，亟需相關(guān)研究來(lái)闡明LD 的發(fā)病機(jī)制等問(wèn)題，為其診療提供線索和依據(jù)。

近年來(lái)，隨著基因測(cè)序分析技術(shù)的盛行，非編碼RNA作為基因調(diào)節(jié)器的一部分在人類(lèi)疾病的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［6-7］，而長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non?coding RNA，lncRNA）更是引起了人們的廣泛關(guān)注［8］。lncRNA是指長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)錄本［9-10］，其生物學(xué)功能包括：①順式或反式轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子；②mRNA加工、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控和蛋白活性的調(diào)節(jié)因子；③核結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)［9］。lncRNA具有多種調(diào)控方式，它不僅可以作為miRNA的前體在生物體內(nèi)發(fā)揮作用，而且還對(duì)mRNA有調(diào)控作用。根據(jù)lncRNA不同的調(diào)控方式，lncRNA與mRNA之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系也較多，包括Antisense 關(guān)系、Cis 關(guān)系以及Trans 關(guān)系，不同的lncRNA?mRNA關(guān)系可能行使不同的功能［11］。先前研究發(fā)現(xiàn)miR?137 可以通過(guò)下調(diào)Aquaporin?2（AQP2）的表達(dá)抑制陰道上皮細(xì)胞的通透性，這表明miRNA可能通過(guò)降低AQP2的蛋白水平參與LD的發(fā)生發(fā)展［12］。因此，有理由認(rèn)為lncRNA可能與LD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，而其間的相互作用也值得深入研究。

本研究為了探索LD 中的差異表達(dá)lncRNA?mRNA 網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)一步了解LD 的潛在發(fā)病機(jī)制，利用下一代測(cè)序中LD 患者lncRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選出陰道上皮組織與對(duì)照組織中差異lncRNA，并以候選lncRNA 為中心構(gòu)建了lncRNA?mRNA 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并預(yù)測(cè)了其生物學(xué)功能。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

研究對(duì)象來(lái)源于南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院美容整形外科，2017年10月—2018年5月對(duì)在此科室行陰道緊縮術(shù)的、無(wú)其他婦科疾病的女性，使用自制問(wèn)卷、焦慮自評(píng)量表（self?rating anxiety scale，SAS）、抑郁自評(píng)量表（self?rating depression scale，SDS）、中文版女性性功能指數(shù)量表（Chinese version of female sexual function index，CVFSFI）收集志愿者的一般資料，并評(píng)估其焦慮抑郁情況及性功能障礙程度。剔除存在焦慮抑郁癥狀的患者后，隨機(jī)選擇6 例陰道潤(rùn)滑維度單項(xiàng)評(píng)分＜3.9 分者作為L(zhǎng)D 組以及6例總體評(píng)分＞25分且LD單項(xiàng)評(píng)分＞3.9分者為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)如下：①成年漢族女性，具有中等以上學(xué)歷；②無(wú)其他基礎(chǔ)婦科疾?。虎塾?jì)劃接受陰道緊縮術(shù)。本研究使用《中文版女性性功能指數(shù)評(píng)估表》進(jìn)行評(píng)估。在手術(shù)過(guò)程中，取LD組和對(duì)照組女性的陰道上皮組織置于凍存管，隨后立即保存在液氮中待用。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（寧婦倫字〔2014〕64號(hào)）。

1.2 方法

1.2.1 組織RNA提取及下一代測(cè)序技術(shù)

組織RNA 提取使用QIAzol 裂解液（Qiagen 公司，德國(guó)）進(jìn)行，按照說(shuō)明書(shū)上的步驟提取樣本總RNA。提取出的樣本RNA 的質(zhì)量和濃度通過(guò)分光光度計(jì)ND?1000（Thermo Fisher 公司，美國(guó)）檢測(cè)。RNA 提取完成后，cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建和下一代測(cè)序全部由北京博奧生物集團(tuán)有限公司完成。RNA 中的rRNA 經(jīng)Ribo?ZeroTMMagnetic Kit（Epicentre 公司，美國(guó)）去除，線性RNA 用Ribonuclease R 酶（Epicen?tre公司，美國(guó)）消化。cDNA文庫(kù)的構(gòu)建根據(jù)TruSeq文庫(kù)構(gòu)建流程完成。通過(guò)Illumina Cluster Genera?tion成簇，通過(guò)Illumina Hiseq 2500完成測(cè)序。

1.2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控

使用FastQC 軟件評(píng)估fastq 格式的原始數(shù)據(jù)的測(cè)序質(zhì)量；使用NGSQC 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，刪除低質(zhì)量及含N 高于5%的不滿(mǎn)足分析標(biāo)準(zhǔn)的reads，得到可用于后續(xù)比對(duì)、統(tǒng)計(jì)以及分析的clean reads；選用人類(lèi)基因組的hg19（UCSC）基因組作為參考，使用具有默認(rèn)參數(shù)的Tophat2 將高質(zhì)量的純凈讀段與參考基因組進(jìn)行比對(duì)。

1.2.3 序列回帖

回帖結(jié)果統(tǒng)計(jì)主要包括對(duì)所有reads 總體的比對(duì)情況統(tǒng)計(jì)以及飽和度分析，通過(guò)Picard 軟件統(tǒng)計(jì)reads 比對(duì)的位置分布、reads 均一性分布等。本研究以reads 的總體回帖率≥70%，且多重比對(duì)率≤10%為回帖標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)reads 回帖到參考基因組上的位置進(jìn)行分類(lèi)得到分布圖，直觀反映出在已有的參考基因組注釋中樣品基因組的轉(zhuǎn)錄情況。同時(shí)，通過(guò)均一性分布圖觀察reads 在基因的不同位置分布情況，若分布相對(duì)比較均勻，則表明cDNA片段化的隨機(jī)性好。

1.2.4 lncRNA表達(dá)量及樣品相關(guān)性分析

新的lncRNA 預(yù)測(cè)主要通過(guò)基本過(guò)濾、編碼能力過(guò)濾等篩選出符合要求的轉(zhuǎn)錄本，將篩選所得的轉(zhuǎn)錄本作為新的lncRNA 進(jìn)行后續(xù)分析，通過(guò)長(zhǎng)度進(jìn)行過(guò)濾。通過(guò)過(guò)濾得到了known lncRNA 及novol lncRNA，合并全部lncRNA以及mRNA得到lncRNA及mRNA的全部轉(zhuǎn)錄本id，根據(jù)轉(zhuǎn)錄本id，在total RNA的表達(dá)量分析列表中分別提取lncRNA 與mRNA 的表達(dá)量，進(jìn)行l(wèi)ncRNA部分樣品的相關(guān)性分析。

1.2.5 差異表達(dá)分析

使用R語(yǔ)言的edgeR/limma軟件包實(shí)現(xiàn)對(duì)LD組和對(duì)照組中l(wèi)ncRNA 以及mRNA 進(jìn)行差異表達(dá)分析。limma包分析過(guò)程中通過(guò)比較假設(shè)檢驗(yàn)來(lái)評(píng)估給定基因集中的基因是否相對(duì)于不在集內(nèi)的基因在差異表達(dá)基因的排序中更靠前。再通過(guò)基因間相關(guān)性和基因集的規(guī)模得到方差膨脹因子，用它調(diào)整基因集檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)值的方差后，將會(huì)返回根據(jù)多重假設(shè)檢驗(yàn)進(jìn)行了校正的P值。在兩個(gè)組中，以差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）絕對(duì)值≥2和P值＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)來(lái)篩選組間顯著差異表達(dá)（Differentially expressed，DE）的DE?lncRNA 以及DE?mRNA。同時(shí)，以皮爾森相關(guān)系數(shù)（Pearson correlation coefficient，PCC）的絕對(duì)值＞0.95 及校正后P值＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合lncRNA和mRNA間的相關(guān)性分析篩選具有相關(guān)關(guān)系的DE?lncRNA及DE?mRNA。用Circos軟件繪制circos圖。

1.2.6 基于DE?lncRNA 和DE?mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建直觀地顯示了lncRNA和mRNA 之間的關(guān)聯(lián)性，其基本方法是對(duì)差異lncRNA 和mRNA 的全部樣本表達(dá)值進(jìn)行相關(guān)性計(jì)算，篩選出顯著相關(guān)的lncRNA?mRNA 關(guān)系對(duì)。通過(guò)R 軟件中的corr.test 函數(shù)計(jì)算基于DE?lncRNA 表達(dá)水平和DE?mRNA 靶向的PCC 值，采用Pearson 相關(guān)系數(shù)，默認(rèn)過(guò)濾閾值為0.99；假設(shè)檢驗(yàn)P值校正采用holm算法，默認(rèn)過(guò)濾閾值為0.05。默認(rèn)不考慮同種RNA 類(lèi)型之間的相關(guān)性。以PCC＞0.95 和P＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)，保留有相關(guān)關(guān)系的DE?lncRNA 和DE?mRNA 作為后續(xù)研究的基礎(chǔ)。使用Cytoscape 軟件實(shí)現(xiàn)lncRNA?mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的可視化。

1.2.7 差異基因功能富集分析

對(duì)顯著性差異表達(dá)的mRNA 進(jìn)行富集分析，以了解mRNA 在LD 中的作用。結(jié)合KEGG orthology based annotation system（KOBAS）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的mRNA 進(jìn)行了通路（pathway）、疾?。╠is?ease）、基因本體學(xué)（gene ontology，GO）和KEGG（kyo?to encyclopedia of genes and genomes）富集分析。利用Benjamini?Hochberg進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)，校正P值＜0.05 被認(rèn)為富集分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，根據(jù)結(jié)果顯示排名前30的通路、疾病和GO富集術(shù)語(yǔ)。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA及mRNA的差異表達(dá)分析

通過(guò)下一代測(cè)序技術(shù)，根據(jù)|Log2FC|≥2、校正后P值＜0.05 的標(biāo)準(zhǔn)篩選出LD 組和對(duì)照組中差異表達(dá)的lncRNA以及mRNA（圖1）。通過(guò)對(duì)LD組和對(duì)照組相關(guān)RNA的差異表達(dá)分析，共得到499條表達(dá)上調(diào)的lncRNA 與337 條表達(dá)下調(diào)的lncRNA，以及1 582 條表達(dá)上調(diào)的mRNA 與633 條表達(dá)下調(diào)的mRNA。后續(xù)研究也以這些差異表達(dá)的基因?yàn)榛A(chǔ)進(jìn)行分析。

圖1 LD組和對(duì)照組lncRNA及mRNA的差異表達(dá)分析Figure 1 Analysis of differential expression of lncRNA and mRNA in the LD group and control group

2.2 基于lncRNA與mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了探索LD組與對(duì)照組差異表達(dá)的lncRNA與mRNA 之間的關(guān)系，使用Cytoscape 軟件進(jìn)一步構(gòu)建了共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)以可視化lncRNA 與mRNA 之間的關(guān)系（圖2）。最終，100個(gè)lncRNA與311個(gè)mRNA 共同參與構(gòu)建了lncRNA?mRNA 的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

圖2 基于差異表達(dá)的lncRNA與mRNA構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)（部分）Figure 2 Co?expression network coustrucfion based on differentially expressed lncRNAs and mRNAs（partial graph）

2.3 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中mRNA的功能富集分析

當(dāng)共表達(dá)結(jié)果得到的mRNA數(shù)量多于20時(shí)，進(jìn)行富集分析。本研究對(duì)顯著關(guān)系對(duì)中的mRNA 對(duì)應(yīng)的基因分別進(jìn)行了疾病、基因本體學(xué)以及通路的富集分析，并展示了富集分析中排名前30項(xiàng)的富集結(jié)果。在疾病富集分析中，發(fā)現(xiàn)顯著富集到的疾病包括Brugada 綜合征（Brugada syndrome）、上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer）、肌原纖維肌病（myo?fibrillar myopathies，MFM）、心肌疾?。╩uscular dis?eases）、擴(kuò)張性心肌?。╠ilated cardiomyopathy，DCM）以及骨密度（bone mineral density）等（表1）。而在隨后的GO 分析中，發(fā)現(xiàn)顯著富集到的生物過(guò)程包括循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育（circulatory system development，GO：0072359）、心血管系統(tǒng)的發(fā)育（cardiovascular system development，GO：0072358）以及單個(gè)組織發(fā)育過(guò)程（single?organism developmental process，GO：0044767）等，顯著富集到的細(xì)胞成分則包括收縮性纖維（contractile fiber，GO：0043292）、Z 盤(pán)（Z disc，GO：0030018）、I帶（I band，GO：0031674）、肌原纖維（myofibril，GO：0030016）以及收縮纖維部分（con?tractile fiber part，GO：0044449）（表2）。而GO 富集分析中的前30 位均與分子功能無(wú)關(guān)。通路富集分析中最顯著富集的通路是cGMP?PKG 信號(hào)通路（cGMP?PKG singling pathway），其后依次為醛固酮調(diào)節(jié)的鈉重吸收（aldosterone?regulated sodium reab?sorption）、肌肉收縮（muscle contraction）、血管平滑肌收縮（vascular smooth muscle contraction）以及內(nèi)分泌和其他因素調(diào)節(jié)的鈣重吸收（endocrine and other factor?regulated calcium reabsorption）（表3）。

表2 GO分析中富集前10的功能Table 2 The top 10 significant enriched GO fuction

表3 GO分析中富集前10的通路Table 3 The top 10 significant enriched pathways

3 討論

近年來(lái)，隨著人們對(duì)健康的關(guān)注及重視，性健康也成為健康的一部分，尤其是FSD 中發(fā)病率最高的LD。當(dāng)前的研究者們對(duì)LD 發(fā)病機(jī)制的研究仍然匱乏，而對(duì)于非編碼RNA的研究讓我們看到了曙光［13］。此外，也不乏非編碼RNA在LD中的研究［5，12］。然而，作為在基因功能和調(diào)控等各個(gè)層面都發(fā)揮著重要作用的lncRNA 卻未見(jiàn)其在LD 中的研究報(bào)道。本研究通過(guò)對(duì)LD 組和對(duì)照組人群的陰道上皮組織進(jìn)行下一代測(cè)序，分別鑒定出499 條表達(dá)上調(diào)的lncRNA和1 582條表達(dá)上調(diào)的mRNA，以及337條表達(dá)下調(diào)的lncRNA 和633 條表達(dá)下調(diào)的mRNA。隨后構(gòu)建了基于差異表達(dá)的lncRNA 和mRNA 的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，并通過(guò)富集分析闡明了與LD 潛在相關(guān)的通路與機(jī)制。

為了進(jìn)一步了解共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中的lncRNA在LD發(fā)生發(fā)展中的生物學(xué)功能，對(duì)網(wǎng)絡(luò)中的mRNA 進(jìn)行了疾病、通路和GO 富集分析。通過(guò)對(duì)結(jié)果的分析表明，LD 的發(fā)生機(jī)制可能與循環(huán)系統(tǒng)的發(fā)育、肌肉的發(fā)育狀況以及cGMP?PKG等信號(hào)通路有關(guān)。研究表明，血管平滑肌收縮會(huì)使得包括陰道、陰蒂在內(nèi)的生殖器官血流量減少，進(jìn)而導(dǎo)致陰道潤(rùn)滑不足、陰蒂勃起無(wú)力［14］。同時(shí)，該研究還證實(shí)NO 相關(guān)的cGMP 途徑可以改善血管平滑肌細(xì)胞的松弛狀態(tài)，這與本研究結(jié)果不謀而合。Park等［15］研究表明，NO?cGMP 信號(hào)通路參與了對(duì)陰蒂腫大的調(diào)節(jié)，這進(jìn)一步表明cGMP 信號(hào)通路有望成為解決LD 的潛在機(jī)制。Comeglio 等［14］研究還表明睪酮可能通過(guò)NO?cGMP 通路調(diào)節(jié)血管舒張功能參與女性性喚起反應(yīng)，雌激素的降低會(huì)導(dǎo)致盆腔內(nèi)血流減少，而這些都可能導(dǎo)致陰道潤(rùn)滑不足乃至障礙的發(fā)生。本研究也表明血循環(huán)障礙可能是導(dǎo)致LD發(fā)生的一個(gè)潛在機(jī)制。此外，先前研究也表明肌肉力量的強(qiáng)弱是性功能中重要的一環(huán)［16］。本研究則顯示心肌功能、肌肉收縮纖維及其組成（Z 盤(pán)、I 帶）可能與LD 的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。綜合以上，猜測(cè)心肌功能障礙可能會(huì)導(dǎo)致血液循環(huán)障礙的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致全身血管血液供應(yīng)出現(xiàn)問(wèn)題，隨之而來(lái)的便是陰道血管收縮舒張功能障礙，性高潮時(shí)的陰道潤(rùn)滑不足。

雖然本研究揭示了一部分和LD 相關(guān)的問(wèn)題，但是也無(wú)法避免其中存在的一些局限性。首先，需要擴(kuò)大樣本量行進(jìn)一步研究。雖然LD的發(fā)病率并不低，但是符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)的患者及正常對(duì)照組并不算多。因此，取到的樣本量也較少。雖然納入研究的樣本量較少，但這也足夠達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。其次，研究發(fā)現(xiàn)了LD的一些潛在機(jī)制，但這僅依賴(lài)于生物信息技術(shù)，還需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)其在細(xì)胞、動(dòng)物乃至人體水平的作用情況，以進(jìn)一步闡釋其作用機(jī)制。

綜上所述，通過(guò)對(duì)LD 組和對(duì)照組女性陰道組織進(jìn)行下一代測(cè)序，發(fā)現(xiàn)部分差異表達(dá)的lncRNA以及mRNA，對(duì)基于其構(gòu)建的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行富集分析發(fā)現(xiàn)，LD 的發(fā)病機(jī)制可能與cGMP 通路、局部肌肉功能障礙、血液循環(huán)功能障礙等有關(guān)。未來(lái)需要更多的基礎(chǔ)及臨床研究來(lái)證實(shí)猜想，以期為L(zhǎng)D患者解決實(shí)際困擾找到合理有效的方案。