程序性細(xì)胞死亡配體1、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶在皮膚瘢痕及瘢痕癌中的表達(dá)及意義

王章奇 何 偉 付凌怡 彭 享 翁錦泉

1.廣東省人民醫(yī)院珠海醫(yī)院 （珠海市金灣中心醫(yī)院）病理科，廣東珠海 519040；2.廣東省人民醫(yī)院珠海醫(yī)院（珠海市金灣中心醫(yī)院）皮膚科，廣東珠海 519040；3.中山大學(xué)附屬腫瘤防治中心，廣東廣州 510000

近年來皮膚腫瘤的發(fā)生率有逐年上升趨勢(shì)，某些皮膚腫瘤是從癌前病變開始慢慢演化而成的，若在其最終變成腫瘤之前對(duì)其識(shí)別并將其扼殺，可有效控制皮膚癌的發(fā)展。瘢痕的形成和發(fā)展與機(jī)體自我修復(fù)過程關(guān)系密切，是傷口愈合的最終產(chǎn)物[1]。而瘢痕癌的病理之一可能為機(jī)體抗腫瘤的免疫效應(yīng)因瘢痕形成而被削弱，致使組織癌變的可能性升高[2]。程序性細(xì)胞死亡受體1（programmed cell death receptor 1，PD-1，CD279）及其配體 PD-L1（programmed cell death ligand 1，CD274）作為一類重要的免疫抑制分子，在機(jī)體的適應(yīng)性免疫抵抗中發(fā)揮著重要作用，目前普遍認(rèn)為，PD-L1 在多種腫瘤的實(shí)體組織中均可檢測(cè)出其高表達(dá)。端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）作為端粒酶的催化亞基，與瘢痕增生、腫瘤永生化密切相關(guān)。但目前關(guān)于PD-L1、TERT在正常皮膚、皮膚病理性瘢痕及皮膚瘢痕癌中的表達(dá)及意義的研究報(bào)道極少，因此本研究對(duì)此進(jìn)行探討，為臨床治療瘢痕癌提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年1月至2019年12月人體正常皮膚組織25例為皮膚組，皮膚病理性瘢痕30例為皮膚瘢痕組，皮膚瘢痕癌35例為瘢痕癌組。所有病例均經(jīng)HE染色、光鏡觀察并明確診斷。瘢痕癌組臨床有病理性瘢痕形成史，確診為皮膚瘢痕癌者，從瘢痕形成到癌變的時(shí)間為1～40年。皮膚瘢痕組臨床有皮膚燒傷、燙傷或機(jī)械性創(chuàng)傷等損傷病史，形成瘢痕的時(shí)間為數(shù)月至20年。

1.2 方法

1.2.1 采用免疫組化二步法染色檢測(cè)PD-L1及TERT蛋白表達(dá)水平 ①切片、脫蠟、水化：標(biāo)本蠟塊制備成4 μm連續(xù)切片，經(jīng)脫蠟和水化，自來水沖洗并浸泡于水中。②過氧化物阻斷：滴加3%過氧化氫溶液室溫作用10 min，PBS 沖洗3遍，每遍5 min。③抗原修復(fù)：置于pH 6.0檸檬酸鹽緩沖液中微波加熱20 min進(jìn)行抗原修復(fù)，自然冷卻至室溫，PBS沖洗3遍，每遍5 min。④一抗孵育：滴加兔抗人PD-L1或TERT多克隆抗體（英國(guó)Abcam公司，1∶200稀釋），4℃孵育過夜，PBS沖洗3遍，每遍5 min。⑤二抗孵育：使用PV-6000二抗試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），每張切片滴加二抗50 μl，室溫條件下孵育20 min，PBS沖洗3遍，每遍5 min。⑥D(zhuǎn)AB顯色：在每張切片上滴加100 μl新鮮配制的DAB顯色劑，室溫下避光顯色，在光學(xué)顯微鏡下控制顯色時(shí)間，3～5 min后蒸餾水沖洗終止顯色。⑦蘇木素襯染及封片：蘇木精復(fù)染1 min，自來水沖洗返藍(lán)，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.2.2 結(jié)果判斷 免疫組化切片均由2名資深病理科醫(yī)師雙盲獨(dú)立觀察評(píng)估。①PD-L1結(jié)果判定以細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色至棕褐色顆粒為陽(yáng)性顯色。②TERT結(jié)果判定以細(xì)胞核出現(xiàn)黃色至棕褐色顆粒為陽(yáng)性顯色。蛋白表達(dá)水平采用半定量積分法，結(jié)合染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞百分比來評(píng)定陽(yáng)性表達(dá)病例。先在低倍鏡下觀察切片整個(gè)視野，分別隨機(jī)選擇5個(gè)高倍視野（×400），染色強(qiáng)度分級(jí)如下：無著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞密度分級(jí)為：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，10%～50%為2分，＞50%為3分。兩項(xiàng)得分相乘結(jié)果≥3分為陽(yáng)性表達(dá)。

1.3 觀察指標(biāo)

①觀察PD-L1蛋白在各組組織細(xì)胞中表達(dá)情況；②觀察TERT蛋白在各組組織細(xì)胞中表達(dá)情況；③比較PD-L1、TERT蛋白在各組組織細(xì)胞中的表達(dá)水平（陽(yáng)性面積）及強(qiáng)度（平均光密度）；④采用Spearman相關(guān)性分析PD-L1、TERT表達(dá)水平的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，采用Spearman相關(guān)性分析PD-L1、TERT表達(dá)水平的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1蛋白在各組組織細(xì)胞中表達(dá)情況

陽(yáng)性表達(dá)出現(xiàn)在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)，呈黃色至棕褐色為陽(yáng)性，皮膚組、瘢痕組及瘢痕癌組分別為陰性、弱陽(yáng)性以及強(qiáng)陽(yáng)性（圖1）。

圖1 PD-L1蛋白在皮膚組、瘢痕組及瘢痕癌組細(xì)胞中表達(dá)情況

注：a.PD-L1在正常皮膚表皮中呈陰性表達(dá)（IHC×400）；b.PD-L1在病理性瘢痕上皮中呈弱陽(yáng)性表達(dá)（IHC ×400）；c.PD-L1在瘢痕癌組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)（IHC×400）

2.2 TERT蛋白在各組組織細(xì)胞中表達(dá)情況

陽(yáng)性表達(dá)位于細(xì)胞核，出現(xiàn)黃色至棕褐色顆粒為陽(yáng)性顯色，皮膚組、瘢痕組及瘢痕癌組分別為陰性、弱陽(yáng)性以及強(qiáng)陽(yáng)性（圖2）。

圖2 TERT蛋白在皮膚組、瘢痕組及瘢痕癌組細(xì)胞中表達(dá)情況

2.3 PD-L1、TERT蛋白在各組組織細(xì)胞中的表達(dá)水平及強(qiáng)度比較

PD-L1的表達(dá)水平與表達(dá)強(qiáng)度，三組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；即瘢痕組與皮膚組比較PD-L1蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），瘢痕癌組與皮膚組、瘢痕組兩兩比較，PD-L1蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TERT的表達(dá)水平與表達(dá)強(qiáng)度，三組之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；即瘢痕組與皮膚組比較，TERT蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），瘢痕癌組與皮膚組、瘢痕組兩兩比較，TERT蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 PD-L1、TERT蛋白在各組組織細(xì)胞中的表達(dá)水平及強(qiáng)度比較（± s）

表1 PD-L1、TERT蛋白在各組組織細(xì)胞中的表達(dá)水平及強(qiáng)度比較（± s）

組別 n PD-L1 TERT陽(yáng)性面積（PA） 平均光密度（AOD） 陽(yáng)性面積（PA） 平均光密度（AOD）皮膚組 25 0.04±0.02 0.18±0.03 0.06±0.03 0.18±0.02瘢痕組 30 0.05±0.02 0.20±0.03 0.09±0.05 0.21±0.03瘢痕癌組 35 0.14±0.04 0.26±0.02 0.17±0.05 0.28±0.04 F值 110.796 76.324 48.529 78.160 P值 0.000 0.000 0.000 0.000 t瘢痕組與皮膚組比較值 1.846 2.462 2.629 4.269 P瘢痕組與皮膚組比較值 0.070 0.017 0.011 0.000 t瘢痕癌組與皮膚組比較值 11.496 12.401 9.798 14.505 P瘢痕癌組與皮膚組比較值 0.000 0.000 0.000 0.000 t瘢痕癌組與瘢痕組比較值 11.176 9.607 6.431 7.871 P瘢痕癌組與瘢痕組比較值 0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 PD-L1、TERT蛋白表達(dá)水平相關(guān)性

經(jīng)過Spearman相關(guān)性分析，PD-L1蛋白的表達(dá)水平與TERT蛋白表達(dá)程度水平（r=0.662，P=0.000）呈正相關(guān)。

3 討論

3.1 PD-L1與皮膚瘢痕癌

PD-1是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白，是維持機(jī)體免疫耐受的重要因子，正常情況下，廣泛表達(dá)于活化的CD4+T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、單核細(xì)胞以及DC表面[3]。PD-L1是PD-1的配體，作為一種免疫抑制分子表達(dá)于腫瘤細(xì)胞表面，腫瘤環(huán)境下，與PD-1結(jié)合形成PD-1/PD-L1信號(hào)通道，滅活腫瘤特異性的T細(xì)胞，是免疫應(yīng)答被阻斷，從而腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的攻擊和殺傷能力被減弱甚至喪失[4-7]。本研究顯示，在瘢痕癌中，PD-L1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，其在瘢痕癌組的表達(dá)水平以及表達(dá)強(qiáng)度均明顯高于正常皮膚組與瘢痕組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明PD-L1高表達(dá)可能與皮膚瘢痕癌的發(fā)生關(guān)系密切。腫瘤組織中PD-L1異常增高，使瘢痕上皮細(xì)胞中的PD-1與之結(jié)合，致瘢痕上皮組織T細(xì)胞失活，阻斷免疫應(yīng)答，形成了腫瘤免疫逃逸，從而促使瘢痕癌的發(fā)生，促進(jìn)其發(fā)生以及導(dǎo)致預(yù)后不良[8]。同時(shí)有相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1還影響腫瘤的增殖、遷移和侵襲能力等，上調(diào)癌組織中的PD-L1表達(dá)，其生物活性亦隨之下降，上調(diào)則上升[9-11]。在正常人體中PD-L1還可在抗原提呈細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)，而在健康皮膚與病理性皮膚瘢痕上皮中，PD-L1的表達(dá)水平（平均面積）并無差異，但瘢痕上皮中PD-L1表達(dá)強(qiáng)度（平均光密度）大于健康皮膚，由此可見PD-L1可能對(duì)正常細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。

3.2 TERT蛋白與皮膚瘢痕癌

TERT作為端粒酶核心的組成部分，在端粒酶的活性調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果顯示TERT在皮膚、瘢痕及瘢痕癌組分別為陰性、弱陽(yáng)性以及強(qiáng)陽(yáng)性；TERT的表達(dá)水平與表達(dá)強(qiáng)度，三組之間有差異，兩兩比較，也均存在差異，表達(dá)水平與表達(dá)強(qiáng)度均為正常皮膚組＜瘢痕組＜瘢痕癌組。同時(shí)相關(guān)研究認(rèn)為，端粒酶可在腫瘤癌前病變組織中呈陽(yáng)性表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞中更是表達(dá)上調(diào)，而在正常的細(xì)胞中卻幾乎檢測(cè)不到，因此，推測(cè)端粒酶是細(xì)胞轉(zhuǎn)變成腫瘤細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵因子[12]。結(jié)合本研究結(jié)果，TERT不僅與腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系，與瘢痕的發(fā)生也存在密切關(guān)系。端粒酶的活性程度，可對(duì)癌細(xì)胞分化程度進(jìn)行客觀反應(yīng)，在臨床上是腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后等方面的重要指標(biāo)[13]。有研究顯示，端粒酶的高表達(dá)可導(dǎo)致機(jī)體部分組織產(chǎn)生過度增生，比如腫瘤細(xì)胞增殖、瘢痕增生等[14-15]。而TERT作為端粒酶的逆轉(zhuǎn)錄酶，只有TERT的激活以及表達(dá)水平增高可進(jìn)一步促進(jìn)端粒酶的表達(dá)增高，在端粒酶的活性調(diào)節(jié)中起到關(guān)鍵作用，因此在腫瘤細(xì)胞和瘢痕上皮細(xì)胞中亦呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)。

3.3 皮膚瘢痕癌中PD-L1與TERT表達(dá)相關(guān)性

皮膚瘢痕癌中PD-L1與TERT蛋白顯示高表達(dá)，兩種蛋白呈正相關(guān)，說明兩種蛋白在皮膚瘢痕癌發(fā)生過程中可能發(fā)揮著協(xié)同作用。TERT蛋白通過調(diào)節(jié)端粒酶活性，使細(xì)胞過度分化，從而促進(jìn)PD-L1的表達(dá)，兩者協(xié)同作用促進(jìn)細(xì)胞的增殖甚至惡性轉(zhuǎn)化。

3.4 本研究局限性

PD-L1、TERT在多數(shù)惡性腫瘤都可表達(dá)，但在瘢痕癌的表達(dá)情況研究甚少，本研究通過文獻(xiàn)檢索分析，僅對(duì)PD-L1、TERT于瘢痕與瘢痕癌的發(fā)生機(jī)制相關(guān)性進(jìn)行了討論。本研究并未對(duì)兩種蛋白實(shí)際對(duì)瘢痕及瘢痕癌的發(fā)展、轉(zhuǎn)移等影響以及PD-L1與TERT表達(dá)相關(guān)性機(jī)制進(jìn)行研究，因此還需進(jìn)一步深入研究，為治療瘢痕癌提供更有利的研究數(shù)據(jù)。

綜上所述，PD-L1、TERT蛋白高表達(dá)可能與皮膚瘢痕癌發(fā)生密切相關(guān)，同時(shí)也可能造成病理性瘢痕發(fā)生癌變。通過阻斷PD-1/PD-L1通路，使兩種蛋白不能結(jié)合，能夠增強(qiáng)腫瘤狀態(tài)下T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷力，以防止發(fā)生病變，同時(shí)通過對(duì)TERT蛋白表達(dá)基因的調(diào)控，可抑制細(xì)胞過度增殖和腫瘤細(xì)胞增殖，降低惡性腫瘤的發(fā)生。