基于胎兒有核紅細(xì)胞建立遺傳性耳聾無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的新方法

張娜蔣刈宋立強(qiáng)鮑文琪高搏袁永一高志英游艷琴侯偉張弢楊貴和王明明*

1 北京貝康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司（北京 101111）

2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所，上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（上海 200011）

3 解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科解放軍總醫(yī)院耳聾病分子診斷中心（北京 100853）

4 解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科（北京 100853）

5 南京大學(xué)現(xiàn)代工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院（南京 210093）

產(chǎn)前診斷能夠?qū)ε咛セ蛱菏欠窕加心承┻z傳病或先天畸形在出生前做出準(zhǔn)確診斷，是預(yù)防和控制出生缺陷的重要手段。耳聾是常見的出生缺陷，超過60%的先天性耳聾是遺傳因素導(dǎo)致的，分子診斷技術(shù)是目前檢測(cè)遺傳性耳聾的主要方法[1]。目前，臨床上獲取胎兒細(xì)胞的金標(biāo)準(zhǔn)是羊膜腔穿刺和宮腔絨毛取樣。這些方法的診斷結(jié)果雖然準(zhǔn)確可靠，但對(duì)孕婦和胎兒有宮內(nèi)感染和流產(chǎn)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[2]。孕婦外周血中的胎兒有核紅細(xì)胞（Fetal Nu‐cleated Red Blood Cells,FNRBCs）含有胎兒全部的基因組，被認(rèn)為是最理想的胎兒遺傳物質(zhì)來源細(xì)胞[3]。但是，20ml孕婦外周血中約含有0～20個(gè)胎兒細(xì)胞[4]，因此要獲得足夠數(shù)量的FNRBCs用于分子診斷必須進(jìn)行富集分離，而體外進(jìn)行FNRBCs富集分離需要大量孕婦外周血液。目前還沒有能夠適用于臨床的FNRBCs富集分離方法。

本文設(shè)計(jì)了一種在體捕獲FNRBCs方法，即將一種可以安全進(jìn)入人體血管的結(jié)構(gòu)和功能化醫(yī)療導(dǎo)絲（functional and structured medical guidewire,FSMW）[5]固定于醫(yī)用注射器活塞上，再在FSMW上包被FNRBCs抗體，制成FNRBCs采集器。采集時(shí)，將注射器通過留置針將FSMW置于孕婦前臂靜脈血管中適當(dāng)時(shí)間，以捕獲孕婦外周血中的FN‐RBCs。整個(gè)采集過程操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴的儀器，對(duì)孕婦傷害性小。本文利用血液循環(huán)模擬裝置進(jìn)行了原位捕獲FNRBCs可行性研究和遺傳性耳聾無創(chuàng)產(chǎn)前診斷新方法的探索。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2018年1月在中國人民解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科足月分娩的健康男性新生兒3例，取每例新生兒臍帶血10ml，EDTA抗凝。

選擇2019年3月-5月在中國人民解放軍總醫(yī)院耳聾病分子診斷中心就診的孕婦5例，分別編號(hào)為C001、C002、C003、C004、C005；取每例孕婦外周血10ml，EDTA抗凝。

本項(xiàng)目通過中國人民解放軍總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理編號(hào)S2016-120-02，在檢測(cè)前孕婦及家屬均被告知并簽署知情同意書。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備采集器

分別稱取 0.06g EDC[1-ethyl-3-（3-dimethyl‐aminopropyl）carbodiimide hydrochlorid, Thermo Fisher]和 NHS （N-hydroxysuccinimide,Thermo Fisher）溶于2ml ddH2O，加入28ml二氧六環(huán)（1,4-Dioxane，阿拉?。湃隖SMW，活化1小時(shí)后加入10μg/ml CD71抗體（sc-32272,SANTA CRUZ BIO‐TECHNOLOGY），4℃孵育24h。

1.2.2 體外捕獲

在體捕獲FNRBCs之前，需要進(jìn)行FNRBCs原位捕獲效率及可行性研究。本文將輸液管和恒流泵組成血液循環(huán)模擬裝置來體外捕獲FNRBCs（見圖1）。根據(jù)手臂靜脈血管直徑（3～5mm）和血流速度（＜90ml/min），確定輸液管直徑為4mm和流速20ml/min。將FNRBCs采集器穿入輸液管中，注入孕婦外周血或新生兒臍血10ml，以流速20ml/min室溫下循環(huán)30min，使FNRBCs被采集器上的抗體捕獲。

圖1 循環(huán)血液模擬裝置Fig.1 The circulating blood simulation device

1.2.3 洗脫

加入0.25%胰酶溶液浸沒導(dǎo)絲，置于37℃水浴消化10min，取出導(dǎo)絲，離心、洗滌后留5μl細(xì)胞懸液。

1.2.4 FISH雜交

3例男性新生兒臍血經(jīng)體外捕獲后，采用An‐euVysion?Multicolor DNA Probe Kit（05J38-050）對(duì)洗脫下來的細(xì)胞進(jìn)行FISH雜交，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.2.5 全基因組擴(kuò)增

參考《胚胎植入前染色體非整倍體檢測(cè)試劑盒（半導(dǎo)體測(cè)序法）》說明書進(jìn)行捕獲細(xì)胞的全基因組擴(kuò)增。

1.2.6 STR分型

用 MicroreaderTM 21 ID System（V4.1，Code:10403421）對(duì)捕獲細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物和孕婦外周血DNA進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，在3100型遺傳分析儀上對(duì)STR基因座進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.7 Sanger測(cè)序及捕獲細(xì)胞來源鑒定

以5例孕婦的捕獲細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物和外周血DNA為遺傳材料，分別對(duì)孕婦本人攜帶的耳聾基因致病性變異位點(diǎn)進(jìn)行片段擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行Sanger測(cè)序。捕獲細(xì)胞Sanger結(jié)果與孕婦外周血DNA Sanger結(jié)果及已知的胎兒羊水穿刺結(jié)果進(jìn)行比較，從而判斷捕獲細(xì)胞的來源。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 FISH雜交結(jié)果

FISH雜交探針的目標(biāo)染色體為18常染色體（橘色）、X染色體（綠色）和Y染色體（紅色）。在3例男性新生兒臍血捕獲細(xì)胞的FISH雜交結(jié)果中，共觀察到3個(gè)有明確信號(hào)的有核細(xì)胞，核型為46,XY（見圖2）。此實(shí)驗(yàn)證明體外捕獲體系是可行的。

圖2 FISH結(jié)果（100×）Fig.2 The results of FISH(100×)

2.2 全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物

5例孕婦外周血捕獲細(xì)胞全基因組擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)1.7-2.5μg。

2.3 STR分型結(jié)果

STR分型結(jié)果顯示同一孕婦的捕獲細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物與外周血DNA存在1或多個(gè)明顯差異位點(diǎn)（見表1）。如C004的D8S1179基因座，STR分型顯示其捕獲細(xì)胞為三峰，而其外周血DNA為雙峰（見表1，圖3）。STR分型結(jié)果說明捕獲細(xì)胞中存在一定數(shù)量的FNRBCs。

圖3 C004的部分STR基因座擴(kuò)增峰圖Fig.3 The amplification peaks of some STR loci of C004

表1 捕獲細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物與外周血DNA的STR分型差異位點(diǎn)Table 1 The different sites of STR typing between the amplified products of captured cells and the peripheral blood DNA

2.4 Sanger測(cè)序結(jié)果及捕獲細(xì)胞來源鑒定

如表2所示，C004的捕獲細(xì)胞為FNRBCs，而其余4例均為母體細(xì)胞。C004孕婦本人致病性位點(diǎn)為SLC26A4:NM_000441:c.2168A＞G雜合突變，而C004捕獲細(xì)胞Sanger測(cè)序結(jié)果顯示該位點(diǎn)為正常基因型，與胎兒羊水穿刺結(jié)果一致（見表2）。Sanger測(cè)序峰圖顯示捕獲細(xì)胞中有低比例的SLC26A4:NM_000441:c.2168A＞G雜合突變（見圖4）。此結(jié)果說明C004捕獲細(xì)胞中含有較高比例的FNRBCs，也含有少量母體細(xì)胞；同時(shí)表明FNRBCs的陽性率為1/5。

圖4 C004的Sanger峰圖Fig.4 The Sanger peaks of C004

表2 Sanger結(jié)果及捕獲細(xì)胞來源鑒定Table 2 The Sanger results and the source identification of captured cells

3 討論

1969年，Walknowska等[6]發(fā)現(xiàn)母血中含有46,XY男性細(xì)胞，證實(shí)了孕婦外周血中確實(shí)存在胎兒細(xì)胞。這為利用孕婦外周血中胎兒細(xì)胞進(jìn)行非侵入性產(chǎn)前診斷提供了理論依據(jù)。迄今為止已分離出4種胎兒細(xì)胞：滋養(yǎng)層細(xì)胞、胎兒淋巴細(xì)胞、胎兒粒細(xì)胞和FNRBCs。而FNRBCs具有其他細(xì)胞不可比擬的優(yōu)點(diǎn)：①正常人的外周血中不存在有核紅細(xì)胞，若出現(xiàn)則屬于病理現(xiàn)象；②含有胎兒完整基因組，便于遺傳學(xué)和分子生物學(xué)分析；③具有較多且相對(duì)特異的抗原成分如CD71、CD36、GPA、珠蛋白（包括Hbγ、Hbε和Hbζ）和半乳糖殘基等；④妊娠早期大量出現(xiàn)，整個(gè)妊娠期持續(xù)存在，產(chǎn)后約90天在母體外周血中消失，用于診斷時(shí)不受前次妊娠影響等[7-10]。已有報(bào)道利用FNRBCs對(duì)非整倍體[11]、胎兒性別[12]、單基因病如血紅蛋白病[13]和地中海貧血[14]等進(jìn)行檢測(cè)。如Kolialexi等[14]通過磁激活細(xì)胞分選法和單細(xì)胞顯微操作法對(duì)22例孕婦進(jìn)行了FN‐RBCs分離，并用于β地中海貧血的產(chǎn)前診斷。該方法的FNRBCs陽性率為9.8%。雖然這些技術(shù)還處于初期研究階段，但是這些研究結(jié)果為FNRBCs應(yīng)用于臨床疾病的檢測(cè)提供了可能。

胎兒細(xì)胞用于產(chǎn)前診斷所面臨的主要的問題是母血中胎兒細(xì)胞含量稀少和母體細(xì)胞污染，所以需要嚴(yán)格將母血細(xì)胞與胎兒細(xì)胞分離。目前常用的富集分離方法有微流控技術(shù)、流式細(xì)胞儀分選法、磁激活細(xì)胞分選法、密度梯度離心法、親和素分離法和單細(xì)胞顯微操作法等。2002年發(fā)表了以開發(fā)非侵入性產(chǎn)前診斷為目的的前瞻性、多中心研究結(jié)果[15]。該研究以FNRBCs為中心，主要采用兩種策略進(jìn)行FNRBCs富集，分別為磁激活細(xì)胞分選法富集CD71抗體標(biāo)記的細(xì)胞和流式細(xì)胞儀分選法分離血紅蛋白F（HbF）抗體標(biāo)記的細(xì)胞。但研究結(jié)果并不令人滿意，染色體異常樣本中成功捕獲一個(gè)以上胎兒細(xì)胞的比例為74.4%，假陽性率為0.6%～4.1%，該結(jié)果還無法運(yùn)用到臨床檢測(cè)中。與這些方法相比，本文方法操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴儀器，更不需要抽取大量的孕婦外周血。但目前最大問題是捕獲的FNRBCs數(shù)量和純度較低，這主要受限于母血量和抗體的特異性。由于目前還沒有完成安全性評(píng)價(jià)，采集器還不能進(jìn)行孕婦在體捕獲試驗(yàn)，體外捕獲血量無法滿足。抗體方面，目前應(yīng)用較多的是CD71抗體，但CD71也存在于早期紅細(xì)胞、單核細(xì)胞等細(xì)胞膜上，所以用CD71抗體分離FNRBCs會(huì)存在母體細(xì)胞污染[16]。另外，目前最常用的細(xì)胞來源鑒定方法是用Y染色體特異序列探針進(jìn)行FISH雜交，但該方法受到胎兒性別的限制。本文采用了STR分型法，STR廣泛存在于原核生物和真核生物基因組中，符合孟德爾遺傳規(guī)律，胎兒STR分型一半與母親相同，另一半與父親相同。這對(duì)判斷細(xì)胞是否為胎兒細(xì)胞具有重要價(jià)值。該方法對(duì)男女性胎兒均適用，彌補(bǔ)了FISH雜交鑒定細(xì)胞來源受胎兒性別限制的不足。

目前，臨床上獲取胎兒細(xì)胞進(jìn)行產(chǎn)前診斷的金標(biāo)準(zhǔn)是羊膜腔穿刺和宮腔絨毛取樣，但對(duì)孕婦和胎兒有宮內(nèi)感染和流產(chǎn)發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)?；谀秆杏坞xDNA的無創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)（non-invasive prenatal testing，NIPT），由于技術(shù)本身的局限性，僅能作為篩查手段，即NIPT結(jié)果為陽性孕婦，仍需進(jìn)行有創(chuàng)性診斷。隨著單克隆抗體技術(shù)、單細(xì)胞基因診斷技術(shù)的成熟，胎兒細(xì)胞的分離方法較以往得到了明顯改善，可有望從母血中分離出少量胎兒細(xì)胞用于無創(chuàng)產(chǎn)前基因診斷。下一步我們將在孕猴上進(jìn)行在體原位捕獲實(shí)驗(yàn)，以期克服體外捕獲的不利條件，提高捕獲效率和穩(wěn)定性，為孕婦在體捕獲FNRBCs并應(yīng)用于耳聾等遺傳病的產(chǎn)前無創(chuàng)診斷提供更有利的可靠證據(jù)。