遼寧地區(qū)43133例孕婦常見(jiàn)耳聾基因篩查結(jié)果分析

張萌 趙艷輝 趙肖月 趙妍 史楠楠 龐泓

遼寧省沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院遺傳科（沈陽(yáng) 110000）

耳聾在我國(guó)發(fā)病率約1‰～3‰[1]，其中90%以上的耳聾患者出生在無(wú)耳聾家族史的家庭[2]。耳聾的發(fā)生主要與遺傳因素和環(huán)境因素等有關(guān)，其中遺傳因素占60%[3]。遺傳性耳聾根據(jù)患者是否伴有耳外組織器官的發(fā)育異常或功能障礙可分為綜合征型耳聾和非綜合征型耳聾，約70%遺傳性耳聾為非綜合征型，其主要遺傳方式為常染色體隱性遺傳[4]。中國(guó)人群的聾病分子流行病學(xué)調(diào)查顯示：我國(guó)常見(jiàn)的耳聾相關(guān)基因包括GJB2、SLC26A4、mt12srRNA及GJB3[5]。本研究采用微陣列基因芯片技術(shù)對(duì)43133例聽(tīng)力正常孕早期婦女進(jìn)行中國(guó)人常見(jiàn)4個(gè)耳聾基因9個(gè)突變位點(diǎn)的檢測(cè)，探討本地區(qū)聽(tīng)力正常孕早期婦女中常見(jiàn)遺傳性耳聾基因致病突變攜帶情況，建立可行的遺傳性耳聾防控產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷流程。為推廣遺傳性耳聾防控工作提供科學(xué)參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

本研究的研究對(duì)象為2014年7月-2020年11月就診于沈陽(yáng)市婦嬰醫(yī)院產(chǎn)科門診的43133例孕早期孕婦。對(duì)受檢者及其配偶進(jìn)行基本情況的采集，受檢者在充分知情同意的情況下，簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 血液標(biāo)本采集

按照外周血采集標(biāo)準(zhǔn)操作流程，采集受檢者前臂外周血2-3mL到EDTA抗凝管，存放于醫(yī)用冰箱4℃保存。

1.2.2 DNA提取

DNA提取應(yīng)用血液基因組非柱式提取試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），提取DNA合格濃度在 100-200ng/μL，純度 OD260/280在 1.7-2.0之間。

1.2.3 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增

針對(duì)9個(gè)突變位點(diǎn)的9組引物分成A和B兩個(gè)反應(yīng)體系分別進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。將晶芯九項(xiàng)遺傳性耳聾基因芯片檢測(cè)試劑盒（北京博奧生物有限公司）中的PCR擴(kuò)增引物混合物和試劑混合物分別充分混合（A、B管）后分裝，加入3μL的DNA樣本。預(yù)變性處理：37℃10min，95℃15min，96℃1min；擴(kuò)增條件：94℃30s、55℃30s、70℃45s共32個(gè)循環(huán)，60℃10min。

1.2.4 雜交

從同一樣本模版的兩個(gè)不同擴(kuò)增體系管（A、B）中各取3μL PCR產(chǎn)物加入到雜交緩沖液管中，充分混勻后用移液器將雜交反應(yīng)混合物經(jīng)芯片蓋玻片上的加樣孔垂直加入到芯片上后將密封好的雜交盒立即放入60℃的雜交儀器中60min。

1.2.5 芯片洗滌

取出雜交盒中的芯片放入芯片洗干儀中，程序?yàn)椋合礈煲?I，42℃2 min，洗滌液 II，42℃1min×2次。1000rpm離心2min甩干。

1.2.6 芯片掃描及結(jié)果判讀

使用微陣列芯片掃描儀（LuxScan 10K/B）和相應(yīng)的遺傳性耳聾檢測(cè)芯片判別系統(tǒng)進(jìn)行信號(hào)讀取及判斷。針對(duì)9個(gè)突變位點(diǎn)，若在同一位點(diǎn)中只有探針W出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判讀為該位點(diǎn)野生型；只有探針M出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判讀為該位點(diǎn)純合突變型；兩者均出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判讀為該位點(diǎn)雜合突變型。針對(duì)mt12SrRNA基因突變位點(diǎn)，只有探針M出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)判讀為均質(zhì)突變，兩者均出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)判讀為異質(zhì)突變，只有探針W出現(xiàn)陽(yáng)性信號(hào)，判讀為該位點(diǎn)野生型。

1.2.7 基因測(cè)序

對(duì)GJB2和SLC26A4基因突變攜帶者配偶及產(chǎn)前診斷羊水樣本進(jìn)行基因測(cè)序。外周血樣本采用EDTA抗凝管采集3-5mL，產(chǎn)前診斷羊水樣本采用羊水8-10mL離心后使用磁珠提取純化試劑盒（北京天根生化科技有限公司）提取基因組DNA；利用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增富集基因組DNA中靶序列并引入樣本標(biāo)簽序列；利用多重PCR擴(kuò)增技術(shù)擴(kuò)增目的片段經(jīng)純化后，在DNA聚合酶、連接酶、磷酸酶的作用下完成PCR產(chǎn)物兩端特殊接頭的連接，經(jīng)過(guò)純化后完成文庫(kù)的制備；文庫(kù)質(zhì)檢后，將多個(gè)文庫(kù)混合為1個(gè)上機(jī)文庫(kù)；采用雙脫氧鏈終止法在測(cè)序儀（Applied Bio systems 3130，美國(guó)）上進(jìn)行測(cè)序，獲取序列堿基信息，并將測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果

2.1 孕早期婦女基因芯片篩查結(jié)果

43133 例受檢者中，檢出2193例耳聾基因致病突變攜帶者，實(shí)際攜帶者人數(shù)為2167例，其中25例孕婦為雙雜合突變攜帶者及1例孕婦為GJB2基因雜合突變攜帶者同時(shí)伴有mt12SrRNA基因異質(zhì)突變見(jiàn)表1。突變攜帶率為5.08%（2193/43133），檢出GJB2基因1223例（2.84%,1223/43133）、SLC26A4基因 734 例 （1.70%,734/43133）、GJB3基 因 144 例（0.33%,144/43133）、mt12SrRNA基 因 92 例 （0.21%,92/43133），各個(gè)基因的具體位點(diǎn)分布情況見(jiàn)表2。隨訪到的攜帶者孕婦而配偶相應(yīng)基因檢測(cè)未見(jiàn)異常的患者中，暫未發(fā)現(xiàn)新生兒有聽(tīng)力異常者。

表1 26例同時(shí)攜帶兩個(gè)不同耳聾基因變異患者的基因型及表型Table 1 Genotype and phenotype of 26 carriers of double heterozygousvariants of hereditary deafness gene

表2 2193例正常聽(tīng)力孕早期攜帶者各個(gè)基因位點(diǎn)突變種類、例數(shù)及占比Table 2 Mutation types,number and proportion of each gene locus in 2193 normal hearing women in early pregnancy

2.2 攜帶者配偶相應(yīng)基因測(cè)序及結(jié)果

1957例GJB2及SLC26A4基因致病變異孕早期婦女中，1479例配偶知情選擇性進(jìn)行了相應(yīng)基因測(cè)序，檢測(cè)出基因突變攜帶者為115例見(jiàn)表3。其中，發(fā)現(xiàn)夫婦雙方為同一基因致病突變攜帶者43例。另外根據(jù)配偶相關(guān)基因測(cè)序結(jié)果，需要孕婦再次采血進(jìn)行相關(guān)基因測(cè)序的人數(shù)為27例，均未檢測(cè)到存在配偶突變基因上的位點(diǎn)突變。

表3 115例攜帶基因突變的孕婦丈夫相關(guān)基因測(cè)序情況Table 3 Related gene sequencing results of husbands of pregnant women with gene mutation

2.3 基因型沖突夫婦產(chǎn)前診斷結(jié)果及妊娠結(jié)局

為同一基因致病突變攜帶者的43例夫婦中，19例行知情選擇性產(chǎn)前診斷。其中4例胎兒檢測(cè)出同一基因復(fù)合雜合突變；7例胎兒檢測(cè)出單一位點(diǎn)突變，后期隨訪均未發(fā)現(xiàn)新生兒存在聽(tīng)力異常；8例胎兒未檢出致病變異，后期隨訪均未發(fā)現(xiàn)新生兒存在聽(tīng)力異常見(jiàn)表4。

表4 19例行產(chǎn)前診斷家庭基因型分布情況及產(chǎn)前診斷結(jié)果Table 4 Genotype distribution and prenatal diagnosis results of 19 routine prenatal diagnosis families

24例孕婦與配偶基因型沖突但未進(jìn)行產(chǎn)前診斷的家庭中，1例發(fā)生自然流產(chǎn)；2例胎兒出生后診斷為大前庭導(dǎo)水管綜合征并已經(jīng)進(jìn)行了人工耳蝸植入；1例胎兒出生后聽(tīng)力篩查未過(guò)，在進(jìn)一步的診斷和治療中；其余20例新生兒聽(tīng)力暫未見(jiàn)異常。

2.4 攜帶mt12SrRNA基因突變病例的家系分析及用藥指導(dǎo)

共檢測(cè)出mt12SrRNA基因致病變異92例，其中m.1555A＞G均質(zhì)/異質(zhì)突變83例，m.1494C＞T均質(zhì)/異質(zhì)突變9例。對(duì)上述所有受檢者進(jìn)行了詳細(xì)的家系分析及遺傳咨詢。

3 討論

2013年世界衛(wèi)生組織（WHO）發(fā)布的最新評(píng)估數(shù)據(jù)顯示,全球目前共有3.6億人存在不同程度的聽(tīng)力障礙,占全球總?cè)丝诘?%。研究顯示，目前已經(jīng)明確的耳聾相關(guān)基因已有200多個(gè)[6]。在我國(guó)，由常見(jiàn)的耳聾相關(guān)基因GJB2、SLC26A4和mt12SrRNA突變所導(dǎo)致的耳聾占遺傳性耳聾的30%～40%，其中約21%的遺傳性耳聾與GJB2基因相關(guān)，約15%與SLC26A4基因相關(guān)，約4%與mt12SrRNA基因突變相關(guān)[7]。

GJB2基因突變是遺傳性耳聾最常見(jiàn)的致病原因，臨床表型具有明顯的多態(tài)性。GJB2基因編碼縫隙連接蛋白26（Cx26），在聲音傳導(dǎo)過(guò)程中，Cx26蛋白對(duì)鉀離子經(jīng)內(nèi)耳毛細(xì)胞循環(huán)回流進(jìn)入耳蝸內(nèi)淋巴液起調(diào)節(jié)作用，發(fā)生突變后Cx26蛋白的生物活性喪失，鉀離子進(jìn)入內(nèi)淋巴循環(huán)受影響，導(dǎo)致感音神經(jīng)性聾[8]。本地區(qū)育齡期婦女GJB2基因突變檢出率為2.84%（1223/43133），與文獻(xiàn)報(bào)道相似[9,10]。其中c.235delC位點(diǎn)檢出率居首位為2.02%（873/43133），其次為c.299-300delAT位點(diǎn)檢出率為0.56%（241/43133）。根據(jù)對(duì)攜帶GJB2基因突變?cè)袐D配偶的基因檢測(cè)結(jié)果，c.109G＞A位點(diǎn)檢出率最高為32.1%（37/115），該位點(diǎn)突變的致病性既往存在爭(zhēng)議，但目前多數(shù)專家認(rèn)為此突變?nèi)詾橹虏⌒酝蛔儯湟鸬穆?tīng)力表型差異較大[11]，因此在本地區(qū)若GJB2基因（例如c.235delC）突變攜帶者配偶檢出c.109G＞A位點(diǎn)雜合突變，建議行聽(tīng)力檢查監(jiān)測(cè)評(píng)估聽(tīng)力水平，并定期進(jìn)行聽(tīng)力監(jiān)測(cè)。

SLC26A4基因編碼氯-碘離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pen‐drin,作為氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)體，調(diào)節(jié)內(nèi)淋巴液的離子平衡。在內(nèi)耳，氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)障礙可導(dǎo)致內(nèi)淋巴液成分的改變、內(nèi)淋巴囊液體潴留及內(nèi)淋巴管擴(kuò)張。且由于滲透壓改變和成分改變的毒性機(jī)制導(dǎo)致膜迷路感覺(jué)上皮細(xì)胞的損傷，進(jìn)而導(dǎo)致后天中度以上感音神經(jīng)性耳聾[12,13]。本地區(qū)育齡期婦女SLC26A4基因的檢出率為1.7%（734/43133），僅次于GJB2基因，其中c.919-2A＞G位點(diǎn)突變檢出率最高為1.38%（597/43133），與文獻(xiàn)報(bào)道相似[14-16]。在針對(duì)SLC26A4基因突變攜帶者配偶的檢測(cè)中我們發(fā)現(xiàn)，除了c.919-2 A＞G、c.2168A＞G最常見(jiàn)的致病變異以外，還檢出了攜帶c.1975G＞C雜合突變3例、ivs15+5G＞A雜合突變1例、c.1286C＞A雜合突變1例、c.2027T＞A雜合突變1例、ivs19+2T＞A雜合突變1例、c.2029C＞T雜合突變1例、c.1197delT雜合突變1例、c.757A＞G雜合突變1例、c.697G＞C雜合突變1例、c.1522A＞G雜合突變1例，以上突變位點(diǎn)均為致病性突變并且目前尚未納入本地區(qū)常規(guī)遺傳性耳聾基因篩查范圍，這意味著有一部分相關(guān)基因的攜帶者存在漏篩風(fēng)險(xiǎn)并且提示我們擴(kuò)大耳聾基因篩查位點(diǎn)的范圍，提高耳聾相關(guān)基因檢出率。

mt12SrRNA基因突變是藥物性耳聾發(fā)生的遺傳基礎(chǔ)，該基因發(fā)生突變后，使其編碼區(qū)域的結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，改變后的結(jié)構(gòu)與細(xì)菌核糖體基因結(jié)構(gòu)非常相似，當(dāng)接觸氨基糖甙類抗生素時(shí)，它與氨基糖甙類抗生素結(jié)合能力增加，阻礙了線粒體核糖體蛋白的合成，進(jìn)而導(dǎo)致耳蝸的外毛細(xì)胞逐漸死亡導(dǎo)致永久性耳聾[17]。本地區(qū)育齡期婦女mt12SrRNA基因突變的檢出率為0.21%（92/43133），以m.1555A＞G最為常見(jiàn)。由于mt12SrRNA基因的遺傳方式以母系遺傳為主，我們對(duì)所有篩查出該基因的攜帶者均告知被檢者及其母系成員終身禁止使用氨基糖苷類藥物，并且為攜帶者發(fā)放用藥指導(dǎo)卡片，避免藥物聾的發(fā)生。GJB3基因是我國(guó)克隆的第一個(gè)基因，本地區(qū)GJB3基因攜帶率為0.33%（144/43133），該基因538C＞T位點(diǎn)突變被認(rèn)為與高頻聽(tīng)力下降有關(guān)[18]。

大部分以耳聾為唯一癥狀的非綜合征型耳聾主要的遺傳方式為常染色體隱性遺傳，有大量人群為聽(tīng)力正常的隱形耳聾基因攜帶者，因此為生育年齡聽(tīng)力正常人群進(jìn)行常見(jiàn)耳聾基因檢測(cè)是十分必要的。本地區(qū)采用的篩查流程為首先為育齡期婦女進(jìn)行常見(jiàn)耳聾基因篩查，對(duì)攜帶者配偶進(jìn)行相關(guān)基因檢測(cè)，當(dāng)夫婦雙方為同一基因致病突變攜帶者時(shí)，建議在孕婦孕周為16周-22周+6區(qū)間通過(guò)羊水穿刺的方式進(jìn)行產(chǎn)前診斷，對(duì)采集到的羊水細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)基因高通量測(cè)序進(jìn)而明確胎兒基因型，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)降低遺傳性耳聾出生缺陷的目的。本地區(qū)篩查高風(fēng)險(xiǎn)家庭的產(chǎn)前診斷率為44.19%（19/43），在選擇進(jìn)行產(chǎn)前診斷的家庭中，發(fā)現(xiàn)胎兒耳聾風(fēng)險(xiǎn)為100%的家庭占比21.05%（4/19）。根據(jù)隨訪結(jié)果，在24個(gè)放棄產(chǎn)前診斷的高風(fēng)險(xiǎn)家庭中，有3個(gè)家庭胎兒出生后發(fā)現(xiàn)存在聽(tīng)力異常。因此，加強(qiáng)對(duì)耳聾基因的宣傳、加大遺傳咨詢的力度，進(jìn)一步增強(qiáng)大眾對(duì)遺傳性耳聾的認(rèn)知是十分必要的。

耳聾給家庭和社會(huì)都帶來(lái)極大的負(fù)擔(dān)，并且目前沒(méi)有耳聾的有效藥物治療方案，大多數(shù)耳聾患者只能依靠佩戴助聽(tīng)器或植入人工耳蝸等輔助手段進(jìn)行治療，因此做好耳聾的三級(jí)防控工作至關(guān)重要。隨著越來(lái)越多的遺傳性耳聾基因被克隆和鑒定，讓我們可以從分子的水平上全面的認(rèn)識(shí)耳聾發(fā)生發(fā)展的過(guò)程并為臨床上開(kāi)展耳聾基因檢測(cè)與診斷打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此，依靠先進(jìn)的分子檢測(cè)技術(shù)在本地區(qū)建立適宜的遺傳性耳聾基因篩查流程，在原有的基礎(chǔ)上擴(kuò)大致病位點(diǎn)的篩查范圍，并且通過(guò)多方面渠道加強(qiáng)對(duì)遺傳性耳聾的宣傳，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)降低耳聾出生缺陷的防控目標(biāo)。