食品微生物檢測(cè)技術(shù)和方法研究進(jìn)展

秦俊蓮 徐寧寧

摘 要：隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步，食品安全質(zhì)量已經(jīng)成為當(dāng)今備受關(guān)注的社會(huì)問題之一。食品微生物檢測(cè)是食品安全與質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要技術(shù)手段之一，本文對(duì)食品微生物檢測(cè)的方法進(jìn)行了概述，包括傳統(tǒng)檢測(cè)方法、改進(jìn)后的培養(yǎng)檢測(cè)法、代謝技術(shù)法、生物傳感器法、免疫學(xué)技術(shù)法、分子生物學(xué)方法等，以期為食品微生物監(jiān)測(cè)提供參考。

關(guān)鍵詞：食品安全;食品微生物;檢測(cè)技術(shù);方法

Study on Technology and Methods of Food Microbial Detection

Qin Junlian1，2， XU Ningning2

（1.GDZC Foods and Cosmetics Safety Test Center Co.， Ltd.， Zhongshan 528437， China; 2.Institute of Analysis， Guangdong Academy of Sciences （China National Analytical Center， Guangzhou）， Guangzhou 510070， China）

Abstract： With the development of economy and society， food safety has become an important issue in the current social development process. Food microbial detection is one of the important technical means of food hygiene and safety evaluation. In this paper， we focus on the technology and methods of food microbial detection， including conventional detective method， improved culture detective method， metabolism technical method， biosensor method， immunology technical method， molecular biological method， in order to make reference for the food microorganism monitoring.

Keywords： food safety; food microorganisms; detection; methods

隨著國(guó)際食品經(jīng)濟(jì)和貿(mào)易的發(fā)展，食品安全問題受到社會(huì)的廣泛關(guān)注。食源性微生物引起的食品安全風(fēng)險(xiǎn)已成為全球性問題。國(guó)家食品安全調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，2010年以來致病微生物導(dǎo)致的食物中毒事件數(shù)量一直多于化學(xué)性危害和有毒動(dòng)植物造成的危害。在病因明確的食源性疾病暴發(fā)事件中，由微生物因素引起的發(fā)病人數(shù)最多，占總數(shù)的43.88%。據(jù)中國(guó)疾病預(yù)防控制中心統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，近十年，我國(guó)由食源性病原微生物引起的食品安全事故比例高達(dá)60%以上[1]。食源性疾病逐漸成為當(dāng)今世界最突出的食品安全問題，而微生物污染存在于食品的加工、生產(chǎn)和流通等各個(gè)環(huán)節(jié)。微生物檢測(cè)在食品安全評(píng)價(jià)及質(zhì)量監(jiān)控方面發(fā)揮著重要作用，限定食品中微生物存在量的閾值，建立完善的微生物檢測(cè)體系是保障食品安全的重要措施[2]。

食品微生物檢測(cè)主要包括菌落總數(shù)、大腸菌群和致病菌3個(gè)方面的檢測(cè)。檢測(cè)人員對(duì)食品進(jìn)行特殊處理，在特定環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定待測(cè)指標(biāo)。除益生菌以外，一般而言，食品中菌落總數(shù)越多，表示該食品受微生物污染程度越嚴(yán)重，食品安全性越差。大腸菌群包含腸桿菌科的檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、埃希氏菌屬、克雷伯菌屬，屬于能產(chǎn)氣的革蘭氏陰性無芽孢桿菌類，這些細(xì)菌寄居于人或者溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)，可隨大便排出寄主體外，食物受糞便污染的程度用大腸菌群系數(shù)表示。致病菌是指可導(dǎo)致人們產(chǎn)生疾病的細(xì)菌類群，根據(jù)現(xiàn)行有效的食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，致病菌主要指腸道致病菌和致病性球菌，主要包括沙門氏菌、志賀氏菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等，食品安全標(biāo)準(zhǔn)要求食品中致病菌不得檢出。在實(shí)際檢測(cè)工作中，如大腸菌群檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，則該食品受到致病菌污染可能性增加，可進(jìn)行致病菌指標(biāo)檢測(cè)[3]，另外根據(jù)長(zhǎng)期檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)和特定產(chǎn)品類型也可直接進(jìn)行某項(xiàng)致病菌檢測(cè)，如水產(chǎn)品的副溶血性弧菌。根據(jù)檢測(cè)需要，運(yùn)用微生物學(xué)的理論與技術(shù)，檢測(cè)食品中可能存在的微生物的種類、數(shù)量等，以判別食品是否符合國(guó)家食品安全質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的過程為食品微生物檢測(cè)，其主要方法如下。

1 傳統(tǒng)檢測(cè)方法

傳統(tǒng)檢測(cè)方法是基于微生物形態(tài)學(xué)和培養(yǎng)特性為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的方法。長(zhǎng)期以來，傳統(tǒng)食品微生物檢測(cè)一直遵循增菌培養(yǎng)、分離純化、形態(tài)學(xué)和生化、血清學(xué)鑒定的傳統(tǒng)方法。傳統(tǒng)檢測(cè)方法準(zhǔn)確性和靈敏度較高，但檢測(cè)流程繁雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)、準(zhǔn)備和收尾工作繁重、效率不高等問題突出[2]，尤其是部分類別的食品保質(zhì)期短，采用傳統(tǒng)檢測(cè)方法，嚴(yán)重影響和制約了食品在市場(chǎng)上的銷售及流通。此外，傳統(tǒng)檢測(cè)方法無法對(duì)難培養(yǎng)或不可培養(yǎng)的微生物進(jìn)行檢測(cè)。隨著儀器自動(dòng)化、分子生物學(xué)等分析技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)、應(yīng)用并推廣準(zhǔn)確高效的食品微生物檢測(cè)方法是食品安全檢測(cè)的重要目標(biāo)之一。

2 改進(jìn)后的培養(yǎng)檢測(cè)法

基于傳統(tǒng)檢測(cè)方法，對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行改良，在培養(yǎng)過程中加入指示劑、顯色劑、抑菌劑、熒光物質(zhì)等來完善培養(yǎng)，可提高培養(yǎng)基的特異性增菌或分離效果。對(duì)培養(yǎng)基的使用便利性進(jìn)行升級(jí)改進(jìn)，如快速檢測(cè)紙片、集成化生化鑒定試劑條及儀器自動(dòng)化技術(shù)在食品微生物檢測(cè)方面具有顯著優(yōu)點(diǎn)。

3 代謝技術(shù)法

在微生物生長(zhǎng)過程中，可根據(jù)代謝產(chǎn)物變化、生物電阻抗等特征開展微生物檢測(cè)工作，達(dá)到食品微生物安全檢測(cè)目的。利用定量細(xì)菌生長(zhǎng)過程中釋放的熱量變化，以對(duì)微生物定量和定性的技術(shù)稱為微熱量技術(shù)。此外，隨著代謝組學(xué)研究技術(shù)的發(fā)展和微生物揮發(fā)性代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)的建立，食源性致病菌揮發(fā)性代謝產(chǎn)物分析已被建議作為臨床和食品中致病菌鑒別的替代方法[4]。

4 生物傳感器法

生物傳感是指對(duì)生物活性物的理化性質(zhì)變化產(chǎn)生感應(yīng)，它通過物理、化學(xué)換能器捕捉目標(biāo)物與敏感元件之間的反應(yīng)，然后將反應(yīng)的程度用不連續(xù)或連續(xù)的數(shù)字電信號(hào)呈現(xiàn)出來，從而得出目標(biāo)物質(zhì)的濃度。生物傳感器法主要有光學(xué)傳感器、生物發(fā)光傳感器和壓電免疫傳感器三種。光學(xué)傳感器適用于檢測(cè)能產(chǎn)生熒光素的細(xì)菌，但靈敏度不高。生物發(fā)光傳感法特異性好，可區(qū)分活菌體和死菌體，但檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)。壓電免疫傳感器有利于進(jìn)行生命體活動(dòng)的研究，因此成為生物傳感器的研究熱點(diǎn)之一。

5 免疫學(xué)技術(shù)法

利用抗原與抗體間的特異性結(jié)合反應(yīng)，通過病原體的催化作用形成免疫球蛋白，可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品微生物的免疫學(xué)檢測(cè)。目前，免疫學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢測(cè)沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、肉毒梭菌和彎曲桿菌等病原菌。免疫技術(shù)主要包括免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫法和免疫磁珠。免疫層析是根據(jù)免疫抗體-抗原的相互吸附原理設(shè)計(jì)出的一種制備收集或檢測(cè)分析技術(shù)。酶聯(lián)免疫法是一種固相免疫測(cè)定技術(shù)，依據(jù)抗原抗體的特異性，并結(jié)合酶的作用，明確微生物的數(shù)量，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于多細(xì)菌檢測(cè)。免疫磁珠捕獲法是通過免疫磁珠對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行針對(duì)性的富集，提高傳統(tǒng)方法的敏感性?！妒称钒踩珖?guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 總則》（GB 4789.1—2016）已將免疫磁珠捕獲法作為檢驗(yàn)大腸桿菌O157：H7的推薦方法。

6 分子生物學(xué)方法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）成為食品微生物檢測(cè)常用的分子生物學(xué)技術(shù)之一。在食品微生物檢測(cè)技術(shù)中，以具有高度保守的核酸序列為對(duì)象設(shè)計(jì)特異引物進(jìn)行擴(kuò)增，通常為16S rRNA基因的高變異片段，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量或者凝膠電泳聯(lián)合紫外核酸檢測(cè)儀觀察擴(kuò)增結(jié)果，已到達(dá)最終檢測(cè)食品中是否有某種致病菌的存在。在多種分子生物學(xué)手段中，依賴PCR的DNA指紋圖譜技術(shù)、定量PCR技術(shù)、基因探針技術(shù)、多重PCR技術(shù)、基因芯片技術(shù)等均得以廣泛應(yīng)用。此外，還有基于等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）法、NASBA法等也被應(yīng)用到食品微生物檢測(cè)技術(shù)中。

6.1 DNA指紋圖譜技術(shù)

DNA指紋圖譜技術(shù)是基于改進(jìn)的PCR技術(shù)，將目標(biāo)微生物的核酸進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生多條特異性與非特異性的DNA擴(kuò)增片段，而后通過微生物的特有條帶進(jìn)行區(qū)別鑒定。DNA指紋圖譜技術(shù)主要包括隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性（RAPD）技術(shù)和基因內(nèi)重復(fù)性一致序列（ERIC）擴(kuò)增技術(shù)。

6.2 多重PCR技術(shù)

多重PCR技術(shù)是在同一個(gè)反應(yīng)體系中同時(shí)加入多對(duì)特異性引物，如樣品中存在與各引物特異性互補(bǔ)的片段，即可同時(shí)擴(kuò)增，實(shí)現(xiàn)一次擴(kuò)增檢測(cè)多種致病菌的目的。該方法適用于同時(shí)需要檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)菌的樣品，可大大提高檢測(cè)效率。

6.3 定量PCR檢測(cè)技術(shù)

定量PCR檢測(cè)技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入標(biāo)記物，通過標(biāo)記物的量變化或熒光強(qiáng)度變化，同時(shí)實(shí)現(xiàn)定性定量。應(yīng)用較廣泛的技術(shù)包括內(nèi)標(biāo)定量PCR和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。在PCR反應(yīng)管中加入內(nèi)標(biāo)物，可消除PCR擴(kuò)增過程中不同反應(yīng)體系間以及標(biāo)本間存在的差異與干擾，因此，選擇合適的標(biāo)記物是內(nèi)標(biāo)定量PCR方法的關(guān)鍵點(diǎn)之一。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程的手段，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。RUDI等[5]采用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，快速檢測(cè)出了食品樣品中的單核增生李斯特氏菌。此外，其他研究者還利用PCR技術(shù)與免疫磁珠技術(shù)、酶聯(lián)免疫法相結(jié)合，快速測(cè)定了食品中的大腸桿菌和沙門氏菌。

6.4 基因探針檢測(cè)方法

每一種生物都有獨(dú)特的核酸片段，病原微生物也有其特定DNA片段，通過分離和標(biāo)記這些片段可制備出探針。基因探針技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于食品安全微生物檢測(cè)中，可靈敏、快速、直接的檢測(cè)出樣品中的特定目標(biāo)微生物，而不受其他微生物類群存在的干擾。目前，市面上已有多種商品化的基因探針試劑盒出品，如美國(guó)Gene-Trak公司開發(fā)的利用特異的基因探針對(duì)單增李斯特氏菌、沙門氏菌、和大腸桿菌的16S rRNA進(jìn)行檢測(cè)的脫氧核糖核酸雜交篩選比色法試劑盒。

6.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是將大量已按檢測(cè)要求制作好的探針固化，通過一次雜交同時(shí)檢測(cè)多種靶基因的技術(shù)，是目前檢測(cè)食品中有害微生物最有效最高效的手段之一。通過設(shè)計(jì)通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物與含有探針的芯片進(jìn)行雜交，在短時(shí)間內(nèi)即可鑒定出大腸桿菌（3～4 h）、沙門氏菌和葡萄球菌等致病性微生物。KIM等[6]采用比較基因組學(xué)技術(shù)，針對(duì)11種常見的食物源性致病微生物設(shè)計(jì)出了新型探針芯片，與全基因組芯片相比，可更加快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出食品中的致病性微生物。

7 展望

隨著微生物檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，檢測(cè)方法也越來越多樣化。食品微生物檢測(cè)技術(shù)將會(huì)向自動(dòng)化、快速化、靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好以及簡(jiǎn)易、經(jīng)濟(jì)的方向不斷發(fā)展。每一種檢測(cè)方法都有優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，為提高準(zhǔn)確性，在食品檢測(cè)時(shí)可根據(jù)實(shí)際情況選擇合適的方法，也可以選擇幾種方法結(jié)合使用，不斷提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，確保食品在制作、生產(chǎn)、包裝和運(yùn)輸?shù)让總€(gè)環(huán)節(jié)中的質(zhì)量安全。此外，檢驗(yàn)人員在食品微生物檢測(cè)中發(fā)揮著主導(dǎo)作用，要加強(qiáng)其對(duì)檢測(cè)技術(shù)、流程和標(biāo)準(zhǔn)的掌握程度，將理論和實(shí)踐緊密結(jié)合，從而獲得精準(zhǔn)的檢測(cè)結(jié)果。

微生物污染存在于食品工業(yè)生產(chǎn)銷售的整個(gè)過程，微生物種類繁多且容易變異，污染情況和分布規(guī)律復(fù)雜，檢測(cè)技術(shù)相對(duì)落后和控制機(jī)理研究缺乏等諸多原因?yàn)槭称肺⑸餀z測(cè)造成諸多困境。因此，不斷加強(qiáng)我國(guó)食品微生物風(fēng)險(xiǎn)分析能力和微生物定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，以減少與發(fā)達(dá)國(guó)家的差距，切實(shí)保障糧食的質(zhì)量安全，維護(hù)人們的根本利益，勢(shì)在必行。建立食品微生物安全風(fēng)險(xiǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)是保障食品安全的基礎(chǔ)手段之一，此數(shù)據(jù)庫(kù)包括數(shù)據(jù)中心與資源共享平臺(tái)、綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)體系、綜合評(píng)價(jià)指數(shù)模型和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警模型四大關(guān)鍵平臺(tái)，其中綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)體系由微生物菌種資源庫(kù)、微生物檢測(cè)項(xiàng)目庫(kù)、微生物檢測(cè)方法庫(kù)、危害物質(zhì)信息庫(kù)、微生物安全國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)庫(kù)構(gòu)成。通過數(shù)據(jù)庫(kù)掌握了7大類食品的致病微生物污染率及污染水平，為微生物安全研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和菌種資源，對(duì)我國(guó)建設(shè)高水平、高質(zhì)量的食品安全保障體系具有重要意義。綜上所述，食品安全關(guān)系國(guó)計(jì)民生，隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，食品微生物檢測(cè)方法和體系將不斷完善，廣大科研工作者需要共同努力，不斷改進(jìn)和豐富現(xiàn)有的檢測(cè)技術(shù)，研發(fā)開創(chuàng)新的檢測(cè)方法，為食品安全保駕護(hù)航。

參考文獻(xiàn)

[1]吳清平，李玉冬，張菊梅.常見食源性致病菌代謝組學(xué)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào)，2016，43（3）：609-618.

[2]李娜，王一村，高靜靜，等.快速檢測(cè)技術(shù)在食品微生物檢測(cè)中的應(yīng)用研究[J].現(xiàn)代食品，2021，9（46）：162-164.

[3]趙程.食品微生物檢驗(yàn)和檢測(cè)技術(shù)[J].現(xiàn)代食品，

2020，15（35）：120-122.

[4]吳清平.食品微生物安全風(fēng)險(xiǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)在包裝飲用水行業(yè)的應(yīng)用[J].飲料工業(yè)，2015，18（2）：74-77.

[5]RUDI K，NATERSTAD K，DROMTORP S，et al.Detection of viable and dead Listeria monocytogenes on gouda-like cheeses by real-time PCR[J].Lett Appl Microbiol，2005，40（4）：301-306.

[6]KIM H J，PARK S H，LEE T H，et al.Microarray detection of foodborne pathogens using specific probes prepared by comparative genomics[J].Biosens Bioelectron，2008，24（2）：238-246.