不同蛋白水平飼料對(duì)大規(guī)格松浦鏡鯉越冬后體質(zhì)量損失、體成分、抗氧化及蛋白合成基因表達(dá)的影響

范澤 吳迪 李晨輝 張圓圓 李晉南 王連生

摘要：研究不同飼料蛋白水平（24%、26%、28%、30%、32%、34%）對(duì)大規(guī)格松浦鏡鯉越冬前后生長(zhǎng)、體成分、抗氧化及蛋白合成基因表達(dá)的影響，前期進(jìn)行完大規(guī)格松浦鏡鯉對(duì)飼料蛋白質(zhì)適宜需要量的研究試驗(yàn)后，在每個(gè)網(wǎng)箱中保留規(guī)格齊整，質(zhì)量為（694.55±64.72） g的20尾大規(guī)格鯉魚進(jìn)行越冬試驗(yàn)，共18個(gè)網(wǎng)箱（2.0 m×2.0 m×2.0 m），時(shí)間為2019年10月31日至2020年4月28日。越冬期間水溫3～8 ℃。結(jié)果表明，26%蛋白組的體質(zhì)量損失率及肥滿度下降比顯著低于24%、32%、34%蛋白組（P<0.05），24%蛋白組的肝體比下降比顯著高于其他各組（P<0.05）。各組間存活率無顯著差異（P>0.05）。26%蛋白組越冬后肌肉粗蛋白含量顯著高于24%蛋白組，且其下降比顯著低于24%蛋白組（P<0.05）。24%組和32%組的肌肉水分含量顯著高于26%組（P<0.05），32%組肌肉水分增加比顯著高于26%和34%組（P<0.05）。26%蛋白組鯉魚肝胰臟的過氧化氫酶和過氧化物酶活性顯著高于其他各組（P<0.05），超氧化物歧化酶活性顯著高于30%蛋白組（P<0.05），谷胱甘肽含量顯著高于24%蛋白組（P<0.05）。34%蛋白組的丙二醛含量顯著高于其他各組（P<0.05）。26%蛋白組的越冬后肌肉雷帕霉素受體基因表達(dá)量顯著高于24%、34%蛋白組（P<0.05）。26%蛋白組的肌肉4E結(jié)合蛋白1基因表達(dá)量顯著高于其他各組（P<0.05）。26%蛋白組的肌肉S6K蛋白激酶及蛋白激酶B基因表達(dá)量顯著高于除24%蛋白組外的其他各組（P<0.05）。越冬試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，26%蛋白組鯉魚越冬效果最佳，體質(zhì)量損失率及肥滿度下降比均為最低，魚體能夠儲(chǔ)存更多的蛋白質(zhì)，使機(jī)體獲得較強(qiáng)的抗氧化能力和較低的氧化應(yīng)激水平，擁有較強(qiáng)的自身內(nèi)源蛋白質(zhì)合成能力。

關(guān)鍵詞：越冬;飼料蛋白;松浦鏡鯉;體質(zhì)量損失率;抗氧化;蛋白質(zhì)合成

中圖分類號(hào)：S963.1;S965.116? ??文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2021）21-0174-07

收稿日期：2021-04-14

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31802305）;中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（編號(hào)：HSY202111Q）;國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)資助項(xiàng)目。

作者簡(jiǎn)介：范 澤（1992—），男，內(nèi)蒙古扎蘭屯人，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究。 E-mail：dankey1534417945@163.com。

通信作者：王連生，博士，副研究員，長(zhǎng)期從事水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究。E-mail：wangliansheng@hrfri.ac.cn。

鯉魚作為池塘養(yǎng)殖的主要品種，2017—2019年其產(chǎn)量穩(wěn)居國(guó)內(nèi)第4名，已成為我國(guó)主導(dǎo)水產(chǎn)淡水養(yǎng)殖品種之一[1]。作為我國(guó)鯉魚主養(yǎng)區(qū)，“三北”（東北、華北、西北）地區(qū)的鯉魚年產(chǎn)量約占池塘養(yǎng)殖總量的50%～60%。這些地區(qū)與其他鯉魚養(yǎng)殖地區(qū)最主要的差異在于冬季更為漫長(zhǎng)寒冷。因此，在這些地區(qū)越冬成為鯉魚養(yǎng)殖非常重要的一個(gè)階段，當(dāng)年魚種的越冬體質(zhì)量損失勢(shì)必會(huì)降低越冬成活率和影響魚體生理生化狀態(tài)的恢復(fù)，進(jìn)而影響翌年魚種的生長(zhǎng)和品質(zhì)，致使養(yǎng)殖收益降低。深入研究越冬對(duì)鯉魚生理生化狀態(tài)的影響是推動(dòng)鯉魚健康養(yǎng)殖的基礎(chǔ)且也是必要的工作。目前，有關(guān)越冬影響鯉魚生理機(jī)能變化已有相關(guān)研究[2]。除此之外，越冬前投喂飼料的質(zhì)量及營(yíng)養(yǎng)水平也影響著魚體在越冬過程中的生理生化水平，但有關(guān)飼料營(yíng)養(yǎng)對(duì)鯉魚越冬的影響鮮有報(bào)道。

蛋白質(zhì)作為漁用飼料中最重要的營(yíng)養(yǎng)成分，不僅決定著各組織器官的生長(zhǎng)和修復(fù)，也是組成酶、激素和抗體等生物活性物質(zhì)的主要成分[3]。飼料中適宜的蛋白水平能夠促進(jìn)魚類的生長(zhǎng)和維持機(jī)體正常代謝，但過低或過高的蛋白水平均會(huì)影響機(jī)體的正常生長(zhǎng)發(fā)育[4-6]。目前，從研究指標(biāo)來看，飼料蛋白水平對(duì)鯉魚影響的研究主要集中于生長(zhǎng)性能、體成分[7]、消化酶活性、抗氧化能力[8]等方面，缺乏針對(duì)越冬的試驗(yàn)研究。

松浦鏡鯉于2008年通過全國(guó)水產(chǎn)原種和良種審定委員會(huì)審定，在10多年的推廣過程中，養(yǎng)殖規(guī)模和分布地域逐年擴(kuò)大，取得了良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，已成為我國(guó)鯉魚主要的養(yǎng)殖品種[9]。筆者所在課題組在先前的研究中發(fā)現(xiàn)大規(guī)格松浦鏡鯉（246.00±17.36） g對(duì)飼料蛋白質(zhì)最適需求量分別為26%[10]。本試驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上探討飼料蛋白水平對(duì)大規(guī)格松浦鏡鯉越冬前后生長(zhǎng)、體成分、抗氧化及蛋白合成基因表達(dá)的影響，研究飼料蛋白水平與鯉魚越冬的關(guān)系，為鯉魚在北方越冬期及越冬后的健康養(yǎng)殖提供科學(xué)依據(jù)和基礎(chǔ)，為開發(fā)有利于鯉魚越冬的飼料提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)飼料

以魚粉、豆粕為蛋白質(zhì)源，豆油為脂肪源，通過設(shè)置不同水平的豆粕及次粉配制24%、26%、28%、30%、32%、34%等6組蛋白水平的試驗(yàn)飼料，其組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。飼料制作在哈爾濱市合禾飼料有限責(zé)任公司完成，首先將所有干性原料經(jīng)粉碎機(jī)后，過60目篩，按逐級(jí)放大原則使用混勻機(jī)攪拌混勻，后依據(jù)飼料配方比例加入豆油，在混勻機(jī)中充分混合后使用飼料制粒機(jī)制成直徑為3.00 mm的沉性顆粒飼料。

1.2 試驗(yàn)魚及飼養(yǎng)管理

在進(jìn)行完大規(guī)格松浦鏡鯉對(duì)飼料蛋白質(zhì)適宜需要量的研究試驗(yàn)后（2019年10月底），在每個(gè)網(wǎng)箱中保留規(guī)格齊整，質(zhì)量為（694.46±64.72） g的20尾大規(guī)格鯉魚進(jìn)行越冬試驗(yàn)，共18個(gè)網(wǎng)箱（2.0 m×2.0 m×2.0 m），越冬期間不投喂任何食物，只進(jìn)行水溫檢測(cè)。越冬試驗(yàn)時(shí)間為2019年10月31日至2020年4月28日。越冬期間水溫3～8 ℃。

1.3 樣本采集

越冬周期結(jié)束后對(duì)試驗(yàn)魚進(jìn)行計(jì)數(shù)并對(duì)所有試驗(yàn)魚進(jìn)行稱質(zhì)量，以計(jì)算存活率及增質(zhì)量率;從每箱中隨機(jī)取3尾魚，對(duì)其體長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)量，以計(jì)算肥滿度;試驗(yàn)魚于冰盤中迅速解剖取其肝胰臟及肌肉，樣本轉(zhuǎn)入-20 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 生長(zhǎng)指標(biāo)計(jì)算 養(yǎng)殖試驗(yàn)增質(zhì)量率=（養(yǎng)殖試驗(yàn)平均終末體質(zhì)量-養(yǎng)殖試驗(yàn)平均初始體質(zhì)量）×100%/（養(yǎng)殖試驗(yàn)平均初始體質(zhì)量）;養(yǎng)殖試驗(yàn)肥滿度（g/cm3）=（養(yǎng)殖試驗(yàn)平均終末體質(zhì)量）/（養(yǎng)殖試驗(yàn)平均終末魚體長(zhǎng)）3;養(yǎng)殖試驗(yàn)肝體比=（養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束時(shí)肝胰臟質(zhì)量）×100%/（養(yǎng)殖試驗(yàn)平均終末體質(zhì)量）;越冬后體質(zhì)量損失率=（養(yǎng)殖試驗(yàn)平均終末體質(zhì)量-越冬后平均體質(zhì)量）×100%/（養(yǎng)殖殖試驗(yàn)平均終末體質(zhì)量）;越冬后肥滿度（g/cm3）=（越冬后平均體質(zhì)量）/（越冬后平均終末魚體長(zhǎng)）3;肥滿度下降比=（養(yǎng)殖試驗(yàn)肥滿度-越冬后肥滿度）×100%/（養(yǎng)殖試驗(yàn)肥滿度）;越冬后肝體比=（越冬后肝胰臟質(zhì)量）×100%/越冬后平均終末體質(zhì)量;肝體比下降比=（養(yǎng)殖試驗(yàn)肝體比-越冬后肝體比）×100%/養(yǎng)殖試驗(yàn)肝體比;

肌肉粗蛋白下降比=（越冬前粗蛋白含量-越冬后粗蛋白含量）×100%/越冬前粗蛋白含量;肌肉粗脂肪增加比=（越冬后粗脂肪含量-越冬前粗脂肪含量）×100%/越冬前粗脂肪含量;肌肉水分增加比=（越冬后水分含量-越冬前水分含量）×100%/越冬前水分含量;越冬存活率=（越冬后試驗(yàn)魚尾數(shù)）×100%/（越冬前試驗(yàn)魚尾數(shù)）。

1.4.2 肌肉成分的測(cè)定 粗脂肪含量采用索氏抽提法（GB/T 6433—1994飼料粗脂肪測(cè)定方法）進(jìn)行測(cè)定，水分及灰分分別采用常壓恒溫烘干法（GB 6435—1986飼養(yǎng)水分的測(cè)定方法）測(cè)定，550 ℃ 灼燒法 （GB/T 6438—2007飼料中粗灰分的測(cè)定）進(jìn)行測(cè)定。

1.4.3 肝胰臟抗氧化酶活性的測(cè)定 粗酶液的制備：肝胰臟在冰生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，用移液管加入9倍于組織塊質(zhì)量的預(yù)冷勻漿介質(zhì)（0.85%生理鹽水），使用電動(dòng)勻漿器進(jìn)行勻漿，4 ℃ 4 500 r/min離心15 min，取上清液于 -80 ℃ 冰箱備用。肝胰臟中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、過氧化物酶活性和谷胱甘肽、丙二醛含量使用南京建成生物工程研究所試劑盒測(cè)定（貨號(hào)分別是：A001-3、A007-1-1、A084-1-1、A006-2-1、A003-1）。

1.5 蛋白質(zhì)代謝相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量測(cè)定

越冬周期結(jié)束后每個(gè)網(wǎng)箱隨機(jī)取3尾魚，取其肝胰臟于液氮中研磨。利用Trizol法提取各組織總RNA，參照TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）（Code No：RR047A）說明書，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

根據(jù)GenBank中現(xiàn)有的鯉魚雷帕霉素靶蛋白、4E-結(jié)合蛋白1、磷脂酰肌醇-3-激酶、蛋白激酶B、S6K蛋白激酶及β-actin保守序列設(shè)計(jì)引物。所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（表2）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（Code：RR420A）試劑盒說明書進(jìn)行，采用SYBR Green染色法，在Applied Biosystems 7500 Real Time PCR System實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)系統(tǒng)下進(jìn)行。為了避免擴(kuò)增批次間存在差異，目的基因與其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參基因同時(shí)擴(kuò)增，每個(gè)模板均做3個(gè)重復(fù)，得到3個(gè)CT值，取其平均值作為最終CT值，后運(yùn)用比較CT法（ΔΔCT）對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較進(jìn)而得到各模板中各基因的相對(duì)表達(dá)量，計(jì)算公式為：相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCT=2-[（CT處理-CT內(nèi)參）-（CT對(duì)照-CT內(nèi)參）]。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有數(shù)據(jù)均用Excel 2007及SPSS 22進(jìn)行分析處理。利用Excel軟件制作各指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出各樣品中對(duì)應(yīng)指標(biāo)的活性含量。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA），差異達(dá)到顯著水平（P<0.05），則進(jìn)行Duncans新復(fù)極差法多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蛋白水平飼料對(duì)松浦鏡鯉越冬后魚體質(zhì)量及存活率的影響

從表3可以看出，越冬前的8周養(yǎng)殖試驗(yàn)中，26%蛋白組的平均質(zhì)量為（758.50±51.83） g，顯著高于32%蛋白組（629.62±6.69） g、34%蛋白組（670.74±17.01） g（P<0.05），26%蛋白組增質(zhì)量率為（197.33±8.84）%顯著高于其他各組（P<0.05）。越冬后，各蛋白水平組鯉魚體質(zhì)量呈現(xiàn)一定比例下降，其中26%蛋白組的越冬后體質(zhì)量為（709.79±45.82） g，顯著高于32%蛋白組（572.53±4.70） g，其體質(zhì)量損失率為（6.37±1.02）%顯著低于24%、32%、34%蛋白組（P<0.05）。越冬存活率在各組間無顯著差異（P>0.05），以24%蛋白組為最低（94.91±2.89）%。

2.2 不同蛋白水平飼料對(duì)松浦鏡鯉越冬后形體指標(biāo)的影響

從表4可以看出，各蛋白水平組的肥滿度和肝體比均表現(xiàn)出一定比例的下降。越冬前，各組間肥滿度無顯著差異（P>0.05），而越冬后，26%蛋白組的肥滿度為（3.57±0.12） g/cm3，顯著高于其他各組（P<0.05），其下降比為（1.64±0.49）%，顯著低于其余各組。越冬前，各組間肝體比亦無顯著差異，而越冬后，26%蛋白組為（1.54±0.15）%和28%蛋白組為（1.53±0.19）%的肝體比顯著低于其他各組（P<0.05）。24%蛋白組的肝體比下降比為（24.77%±7.63%）顯著高于其他各組（P<0.05），其他各組間無顯著差異（P>0.05）。

2.3 不同蛋白水平飼料對(duì)松浦鏡鯉越冬后肌肉營(yíng)養(yǎng)成分的影響

從表5可以看出，各蛋白水平組越冬后肌肉粗蛋白呈現(xiàn)一定比例的下降，其中26%蛋白組越冬后肌肉粗蛋白含量為（15.74±0.07）%最高，顯著高于24%蛋白組（7.25±0.32）%，且其下降比為最低（7.45±1.44）%，顯著低于其余各組（P<0.05）。各蛋白水平組越冬后肌肉粗脂肪呈現(xiàn)一定比例的增加，28%蛋白組的越冬后肌肉粗脂肪含量為（6.15±0.73）%顯著高于24%蛋白組（5.37±0.30）%和30%蛋白組（5.15±0.16）%（P<0.05），32%蛋白組的粗脂肪增加比為（134.90±11.14）%顯著高于其他各組（P<0.05）。各蛋白水平組越冬后肌肉水分整體呈現(xiàn)一定比例的增加，但各組間水分增加比并無顯著差異（P<0.05），24%蛋白組的越冬后肌肉水分含量為（79.00±0.31）%顯著高于28%蛋白組（77.54±0.49）%（P<0.05），32%組肌肉水分增加比顯著高于26%和34%組（P<0.05）。

2.4 不同蛋白水平飼料對(duì)松浦鏡鯉越冬后肝胰臟抗氧化酶活性的影響

從表6可以看出，越冬后26%蛋白組鯉魚的過氧化氫酶和過氧化物酶活性顯著高于其他各組（P<0.05），超氧化物歧化酶活性顯著高于30%蛋白組（P<0.05），谷胱甘肽含量顯著高于24%蛋白組（P<0.05）。越冬后34%蛋白組的丙二醛含量顯著高于其他各組（P<0.05）。

2.5 不同蛋白水平飼料對(duì)松浦鏡鯉越冬后蛋白合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

從表7可以看出，26%蛋白組的越冬后肌肉雷帕霉素靶蛋白基因相對(duì)表達(dá)量與28%蛋白組并列最高，顯著高于24%、34%蛋白組（P<0.05）。26%蛋白組的越冬后肌肉4E-結(jié)合蛋白1基因相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于其他各組（P<0.05）。26%蛋白組的越冬后肌肉蛋白激酶B基因相對(duì)表達(dá)量最高，顯著高于除24%蛋白組以外的其他各組（P<0.05）。

3 討論與結(jié)論

松浦鏡鯉是在德國(guó)鏡鯉選育系基礎(chǔ)上進(jìn)一步培育出的，無論在鱗被、生長(zhǎng)，還是在抗逆、抗病方面較德國(guó)鏡鯉具有較為顯著的優(yōu)勢(shì)[11]。于淼從形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及生化組成等3個(gè)方面綜合分析了越冬對(duì)松浦鏡鯉生存、生長(zhǎng)的影響[12]。本試驗(yàn)從越冬前飼料蛋白供給水平入手研究飼料營(yíng)養(yǎng)對(duì)鯉魚越冬的潛在影響。

實(shí)際應(yīng)用領(lǐng)域中體質(zhì)量、肥滿度、肝體比常作為評(píng)估魚體生理生化或營(yíng)養(yǎng)狀況的重要參數(shù)。在本試驗(yàn)中，越冬后各蛋白組的體質(zhì)量損失率在6.37%～9.49%，其中以26%蛋白組的體質(zhì)量損失率為最低;各蛋白組的肥滿度下降比在5.89%～23.61%，其中以26%蛋白組為最低，而于淼發(fā)現(xiàn)越冬后松浦鏡鯉（248.87 ±15.75） g的體質(zhì)量損失率達(dá)10.8%，肥滿度降低比達(dá)23.26%[12]。而這種差異可能主要源于2個(gè)方面：（1）一般而言，魚規(guī)格大且肥滿度高，則越冬效果好[13]。在本研究中松浦鏡鯉越冬前體質(zhì)量均為（694.55±64.72） g，而后者的松浦鏡鯉越冬前體質(zhì)量均為（248.87±15.75） g，規(guī)格差異影響了二者的越冬效果;（2）除規(guī)格外，越冬前飼料營(yíng)養(yǎng)供給會(huì)影響魚類的越冬效果。Charo-Karisa等發(fā)現(xiàn)，40%蛋白水平的飼料相較于天然餌料能夠顯著提升尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）的耐寒性[14]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)越冬前飼料蛋白水平在26%時(shí)，松浦鏡鯉的體質(zhì)量損失率為（6.37±1.02）%，相較于于淼的研究結(jié)果[12]，體質(zhì)量損失率大約降低3.5%，而當(dāng)飼料蛋白水平低于26%或高于30%時(shí)，體質(zhì)量損失率則會(huì)顯著上升，表明越冬前適宜飼料蛋白供給能夠促進(jìn)魚類平穩(wěn)越冬，飼料蛋白供給過多或過少均會(huì)影響魚類越冬效果。在形態(tài)學(xué)指標(biāo)中，肝體比可直接反映魚類營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)。越冬期間由于低溫和饑餓的雙重限制，魚體分解肝臟內(nèi)的能源物供能，降低肝質(zhì)量，肝體比也隨之降低[15-16]，本試驗(yàn)結(jié)果同樣印證了上述觀點(diǎn)。但需要指出的是本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同蛋白組間肝體比下降比存在較大差異，其中以24%蛋白組的下降比顯著高于其他各組，這可能與越冬前飼料蛋白供給過少影響鯉魚魚體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)儲(chǔ)備有關(guān)，越冬期間需要大量消耗肝胰臟的儲(chǔ)能物質(zhì)，以維持機(jī)體正常的生理機(jī)能。

魚的種類及食性、溫度、越冬前營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、饑餓程度的差異均與越冬時(shí)魚類營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的順序先后和數(shù)量多少密切相關(guān)。于淼研究發(fā)現(xiàn)，在冰下階段（170～325 d）肌肉蛋白質(zhì)開始消耗，整個(gè)越冬期肌肉蛋白質(zhì)含量下降比為5.35%，越冬后肌肉脂肪含量與體質(zhì)量損失率呈顯著負(fù)相關(guān)，說明越冬后肌肉蛋白水平能體現(xiàn)越冬期體質(zhì)量損失程度[12]。本研究主要考察了飼料蛋白水平對(duì)整個(gè)越冬期肌肉營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的影響情況，初步探討飼料外源營(yíng)養(yǎng)如何影響松浦鏡鯉內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)在越冬期間的利用。經(jīng)歷整個(gè)越冬期，各蛋白組的肌肉粗蛋白含量均減少，下降比在8.97%～24.38%之間，以26%蛋白組的下降比為最低，24%蛋白組的下降比為最高，與于淼的研究結(jié)果[12]相比，本試驗(yàn)中各蛋白組松浦鏡鯉的肌肉粗蛋白含量下降比均處于高位，表明規(guī)格差異可能是影響越冬過程中機(jī)體營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用的關(guān)鍵因素。同時(shí)表明越冬前飼料蛋白供給過少會(huì)影響魚體肌肉蛋白質(zhì)的沉積及能量物質(zhì)的儲(chǔ)備，使得過多的蛋白質(zhì)用于維持機(jī)體的正常能量供應(yīng)，這一點(diǎn)也被越冬后肌肉脂肪含量的變化情況所證實(shí)。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，越冬后各蛋白組松浦鏡鯉肌肉脂肪含量相較于越冬前顯著提升，主要原因可能是越冬期間機(jī)體脂肪持續(xù)供能，致使越冬后期脂肪含量已處于較低水平，造成供能不足，因此機(jī)體動(dòng)用蛋白質(zhì)氧化分解供能，并轉(zhuǎn)化為脂肪和糖類。蛋白質(zhì)氧化分解的程度可能是影響松浦鏡鯉越冬后代謝機(jī)能恢復(fù)的主要因素，但其具體作用機(jī)制需要進(jìn)一步研究。此外，越冬期間各試驗(yàn)組松浦鏡鯉肌肉水分含量明顯增加，原因可能是體液將蛋白質(zhì)和脂肪分解代謝后留出的空間充滿，增加了肌肉水分含量[16]。這與其他魚類饑餓狀態(tài)下肌肉水分含量變化情況相似[17]。

越冬期間，魚類需克服來自低溫冷應(yīng)激和食物匱乏的雙重壓力。相關(guān)研究表明，急性和慢性冷應(yīng)激、長(zhǎng)期饑餓都會(huì)引起魚類組織中的氧化應(yīng)激[18-20]。鯉魚在長(zhǎng)期冷應(yīng)激后，肝臟和白肌中的抗氧化酶基因的表達(dá)也出現(xiàn)顯著升高[21]。因此，氧化損傷和抗氧化能力能夠反映越冬后魚類的健康狀況[22]。武文一研究發(fā)現(xiàn)，越冬前強(qiáng)化飼料中含有31.53%蛋白和4%脂肪，降低了越冬期間草魚初始體質(zhì)量（27.55±1.57） g產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，提升了魚體的抗氧化能力，保證了草魚的安全越冬[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，無論是在抗氧化酶活性方面，還是氧化產(chǎn)物丙二醛含量方面，26%蛋白組均表現(xiàn)最優(yōu)，使機(jī)體獲得了較強(qiáng)的抗氧化能力和較低的氧化應(yīng)激水平。因此，明確養(yǎng)殖魚類越冬前最佳飼料蛋白質(zhì)供給水平有助于魚類在越冬期間擁有更強(qiáng)的抗氧化能力和免疫能力，有利于魚類安全越冬。

低溫冷應(yīng)激影響蛋白質(zhì)的分解和合成代謝[24]。魚類生長(zhǎng)是機(jī)體合成代謝不斷積累的結(jié)果，低溫冷應(yīng)激除了通過限制魚體攝食和消化吸收功能，減少合成代謝所需的營(yíng)養(yǎng)原料而降低魚類的生長(zhǎng)速度外[25]，還會(huì)通過影響機(jī)體蛋白質(zhì)合成通路相關(guān)基因的表達(dá)，制約機(jī)體的蛋白合成能力[26]。雷帕霉素受體信號(hào)通路是影響魚類蛋白質(zhì)合成的主要信號(hào)通路，活化后的雷帕霉素靶蛋白可以調(diào)節(jié)2條平行的信號(hào)通路：4E-結(jié)合蛋白通路和S6激酶通路。雷帕霉素受體復(fù)合物直接磷酸化4E-結(jié)合蛋白和S6K蛋白激酶，從而促進(jìn)蛋白合成[27-28]。魯棟梁研究發(fā)現(xiàn)，在低溫條件下饑餓3 d顯著降低了斑馬魚雷帕霉素靶蛋白和S6K蛋白激酶蛋白的磷酸化水平及基因表達(dá)水平[26]，揭示雷帕霉素受體信號(hào)通路對(duì)斑馬魚冷應(yīng)激耐受機(jī)制有一定的調(diào)控作用，同時(shí)抑制雷帕霉素受體信號(hào)通路可能是饑餓激活各種冷應(yīng)激耐受機(jī)制的調(diào)控途徑。在筆者所在課題組前期的研究中發(fā)現(xiàn)，26%蛋白水平能夠顯著提升松浦鏡鯉肌肉蛋白合成相關(guān)基因的表達(dá)[10]。在越冬后，無論是哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶棟（mTOR）信號(hào)通路上游的磷脂酰肌醇-3-激酶和蛋白激酶B基因表達(dá)量，還是雷帕霉素靶蛋白基因表達(dá)量，以及下游的4E-結(jié)合蛋白和S6K蛋白激酶基因表達(dá)量，同樣均以26%蛋白組為最高，表明越冬前適宜的飼料蛋白供給能夠顯著增強(qiáng)機(jī)體蛋白合成能力，有助于機(jī)體在越冬期間自身內(nèi)源蛋白質(zhì)的合成，這與肌肉粗蛋白含量結(jié)果相吻合。此外，與魯棟梁的短期低溫冷應(yīng)激試驗(yàn)[26]不同，首先越冬前期機(jī)體脂肪和糖原為主要功能原料，后期肌肉蛋白質(zhì)參與供能[12]，內(nèi)源蛋白質(zhì)消耗促進(jìn)機(jī)體內(nèi)源蛋白質(zhì)合成，因此雷帕霉素受體信號(hào)通路被激活，相關(guān)蛋白和基因表達(dá)量上升;其次，越冬后期水溫逐漸上升，鯉魚能夠通過攝取底泥中殘留的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，逐步滿足蛋白質(zhì)合成所需的營(yíng)養(yǎng)原料[12]，進(jìn)而激活雷帕霉素受體信號(hào)通路。但飼料蛋白質(zhì)調(diào)控越冬期松浦鏡鯉的肌肉蛋白質(zhì)合成的機(jī)體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

越冬前飼料蛋白水平為26%對(duì)大規(guī)格松浦鏡鯉安全越冬作用最為明顯，效果最佳。在整個(gè)越冬期，26%蛋白組能夠使體質(zhì)量損失率及肥滿度降低比最小化，使魚體能夠儲(chǔ)存更多的蛋白質(zhì)，并獲得較強(qiáng)的抗氧化能力和較低的氧化應(yīng)激水平，擁有較強(qiáng)的自身內(nèi)源蛋白質(zhì)合成能力。

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