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    白刺鏈霉菌CT205誘變及其制劑對(duì)芹菜根腐病的生防效果

    2021-12-09 16:41從炳成王小姣李夢(mèng)雅文麗王世梅
    江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2021年21期

    從炳成 王小姣 李夢(mèng)雅 文麗 王世梅

    摘要:以生防菌株白刺鏈霉菌CT205為材料,通過誘變選育高效突變菌株,并探索其生物制劑對(duì)芹菜根腐病的防控效果。菌株CT205經(jīng)UV-LiCl復(fù)合誘變獲得一株遺傳穩(wěn)定、相對(duì)高效的突變菌株U-L-4,液體發(fā)酵其活性物質(zhì)產(chǎn)量達(dá)到42 mg/L,較野生菌株提高55.56%。利用突變株U-L-4固體發(fā)酵,制備生物有機(jī)肥,通過田間試驗(yàn)防控芹菜土傳病害,結(jié)果表明,施用放線菌生物有機(jī)肥可有效防控芹菜根腐病,顯著促進(jìn)植株生長(zhǎng),芹菜產(chǎn)量增加75.00%,芹菜根際病原真菌-尖胞鐮刀菌數(shù)量顯著降低,改善了芹菜根際微生物群落組成。研究結(jié)果可為生防制劑防控土傳病害提供理論依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:誘變育種;生物防控;芹菜根腐病;微生物群落;白刺鏈霉菌

    中圖分類號(hào): S436.36? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A

    文章編號(hào):1002-1302(2021)21-0138-05

    收稿日期:2021-03-23

    基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(編號(hào):41671256);江蘇省泰州市科技支撐計(jì)劃(農(nóng)業(yè))項(xiàng)目(編號(hào):TN202015)。

    作者簡(jiǎn)介:從炳成(1995—),男,山東濱州人,碩士研究生,研究方向?yàn)橥寥牢⑸?。E-mail:2019103123@njau.edu.cn。

    通信作者:王世梅,博士,教授,主要從事微生物發(fā)酵與土傳病害生物防治。E-mail:smwang@njau.edu.cn。

    芹菜是傘形科耐寒性蔬菜,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,具有降血壓、清腸利便、利尿消腫等作用[1-2]。近年來芹菜連作普遍,土傳根腐病時(shí)常發(fā)生,嚴(yán)重影響產(chǎn)量[3]。芹菜根腐病致病菌主要有尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、側(cè)雄腐霉菌(Pythium paroecandrum)及核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)等,病原菌的孢子或菌核可在土壤中潛伏多年,常規(guī)的物理及化學(xué)手段難以有效根除,生物防控綠色、高效,近年通過生防制劑防控土傳病害的有效案例多有報(bào)道[4]。

    放線菌在防控土傳病害、促進(jìn)植株生長(zhǎng)等方面發(fā)揮著重要作用。文獻(xiàn)報(bào)道,放線菌具有產(chǎn)生拮抗物質(zhì)及改善根際微生物群落結(jié)構(gòu)達(dá)到防控植物病害的作用[5-6]。由于微生物的遺傳不穩(wěn)定性,隨著菌株傳代次數(shù)的增加,拮抗菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的能力會(huì)下降,經(jīng)過誘變處理可獲得相對(duì)高產(chǎn)的菌株,單一誘變劑誘變微生物的方法很多,但突變株易發(fā)生回復(fù)突變[7],而多種誘變劑的復(fù)合誘變具有協(xié)同、高效的作用。白刺鏈霉菌(Streptomyces albospinus)CT205是實(shí)驗(yàn)室保存的一株抗菌譜廣泛、對(duì)植物真菌病害具有良好防控效果的生防菌株,其代謝產(chǎn)生的活性物質(zhì)為環(huán)己酰亞胺[8-9],本研究通過對(duì)菌株CT205進(jìn)行物理和化學(xué)復(fù)合誘變獲得相對(duì)高效的突變株,制備生防制劑,通過田間試驗(yàn)研究其對(duì)芹菜根腐病的生防效果。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    菌株S. albospinus CT205實(shí)驗(yàn)室保存。種子培養(yǎng)基:葡萄糖45.0 g,大豆粉30.0 g,酵母粉5.0 g,CaCO3 5.0 g,去離子水1 L,pH值 7.5;發(fā)酵培養(yǎng)基:蔗糖 20.0 g,可溶性淀粉 30.0 g,大豆粉 8.0 g,CaCO3 3.0 g,蛋白胨2.0 g,NaCl 2.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,K2HPO4·7H2O 0.5 g,去離子水1 L,pH值8.0。

    1.2 高效生防菌的誘變篩選

    1.2.1 菌株CT205單孢子懸液制備 白刺鏈霉菌菌株CT205劃線接種于PDA平板上,28 ℃培養(yǎng),待分生孢子形成,刮取分生孢子制備孢子懸液,無菌脫脂棉過濾去除菌絲體,然后顯微計(jì)數(shù),將孢子濃度調(diào)整為108個(gè)/mL。

    1.2.2 UV+LiCl復(fù)合誘變及突變株篩選 在直徑90 mm培養(yǎng)皿中加入10 mL孢子懸液,磁力攪拌器放在距離紫外(UV)燈的垂直高度約30 cm處,培養(yǎng)皿放在磁力攪拌器上打開皿蓋,適宜轉(zhuǎn)速緩慢攪動(dòng),照射時(shí)間設(shè)置0.5、1、2、4、6 min等5個(gè)處理,照射結(jié)束暗處理30 min,孢子懸液系列稀釋后,取10-3、10-4系列稀釋液各100 μL,涂布在含有 0.1%~0.6% LiCl的PDA平板上培養(yǎng),每個(gè)處理5個(gè)重復(fù),28 ℃避光培養(yǎng),設(shè)置空白處理對(duì)照。菌落長(zhǎng)出后統(tǒng)計(jì)不同處理菌落致死率,選取致死率 70%~80%的處理,挑選與野生型菌落形態(tài)相似或不同的菌落[10]。先以酵母菌為指示菌通過拮抗圈檢測(cè)拮抗活性進(jìn)行初篩,然后通過搖瓶液體發(fā)酵進(jìn)行復(fù)篩,即菌株的分生孢子接種在種子培養(yǎng)基中,在28 ℃ 170 r/min的搖床中培養(yǎng)48 h,然后轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中于相同條件下培養(yǎng)96 h,發(fā)酵液 6 000 r/min 離心 10 min,取上清液,用生物活性法檢測(cè)發(fā)酵上清液中活性物質(zhì)的含量[11],在此基礎(chǔ)上選擇傳代穩(wěn)定、效價(jià)高的突變菌株制備固體制劑。

    1.2.3 突變株U-L-4對(duì)芹菜根腐病病原菌的拮抗作用 芹菜根腐病病原菌尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum) J01由前期實(shí)驗(yàn)室分離保存,并經(jīng)柯赫氏法則驗(yàn)證其致病性[11]。用平板對(duì)峙法測(cè)試誘變菌株U-L-4及野生株CT205對(duì)病原菌的拮抗效果。將誘變菌株與野生株、F. oxysporum J01分別接種在PDA平板于28 ℃培養(yǎng)7 d。用無菌打孔器打取直徑5 mm的菌塊,將病原菌菌塊放置在PDA平板中央,以菌塊為中心,在距離菌塊 20 mm 處兩側(cè)對(duì)稱接種生防菌株,并設(shè)置對(duì)照,每處理重復(fù)3次,28 ℃培養(yǎng)5 d,測(cè)定菌株對(duì)病原菌的抑制率。抑制率=(對(duì)照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對(duì)照組菌落直徑)×100%。

    1.2.4 突變株的固體發(fā)酵及生物有機(jī)肥制備 根據(jù)前期固體發(fā)酵條件的優(yōu)化,固體發(fā)酵配方由以下比例組成,細(xì)土與沙 ∶麥麩 ∶花生餅 ∶椰糠 ∶小米 ∶肉骨粉=4 ∶2 ∶1 ∶1 ∶1 ∶1,料水比1 ∶0.8,混合攪拌均勻后,裝袋121 ℃ 30 min滅菌,按10%的接種量接種種子液,分裝淺盤,厚度2.0~2.5 cm,28 ℃ 培養(yǎng)14 d,取樣稀釋涂布測(cè)其活菌數(shù)。細(xì)土:取南京麒麟鎮(zhèn)后村菜園土(黃棕壤)研磨處理,細(xì)土與沙過20目篩,肉骨粉由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)資環(huán)學(xué)院李國(guó)慶教授提供。固體發(fā)酵制備的菌劑,按10%比例復(fù)合有機(jī)肥制備生物有機(jī)肥,有機(jī)肥由淮安柴米禾生物科技公司提供。

    1.2.5 田間試驗(yàn) 2019年9—11月,在南京溧水華城蔬菜種植合作社進(jìn)行田間試驗(yàn)。土壤類型為馬肝土,含全氮1.87 g/kg、速效磷172.4 mg/kg、速效鉀155.23 mg/kg、有機(jī)質(zhì)26.77 g/kg,pH值7.18,土壤中尖孢鐮刀菌計(jì)數(shù)為2.3×104 CFU/g。大棚種植前施用普通有機(jī)肥1 500 kg/hm2和三元復(fù)合肥(純N、P2O5、K2O含量均為16%)、尿素(N>46%)、硫酸鉀(K2O>52%)各300 kg/hm2,作基肥,撒施深翻整平、培壟。設(shè)置U-L-4生物有機(jī)肥(108 CFU/g)、木霉生物有機(jī)肥(淮安柴米禾生物科技公司提供,木霉有效活菌數(shù)108 CFU/g)和對(duì)照3個(gè)處理,大棚等面積分9塊,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù),小區(qū)面積2×2 m2。U-L-4生物有機(jī)肥處理減施10%三元復(fù)合肥。

    移栽35 d的芹菜苗,株距20 cm,生物有機(jī)肥處理每株穴施10 g。移栽種植后35 d,統(tǒng)計(jì)不同處理芹菜發(fā)病情況,取不同處理1×1 m2芹菜植株連根拔起,統(tǒng)計(jì)生物量,計(jì)算產(chǎn)量。取芹菜根際土,稀釋涂布法測(cè)定土壤中細(xì)菌、放線菌、真菌以及尖孢鐮刀菌的數(shù)量。尖孢鐮刀菌用Komada選擇性培養(yǎng)基(K2HPO4 1.0 g,MgSO4 0.5 g,KCl 0.5 g,F(xiàn)e-EDTA 0.01 g,天門冬酰胺 2.0 g,D-半乳糖20.0 g,瓊脂20.0 g,去離子水1 L,pH 值7.2~7.4)計(jì)數(shù)。

    1.2.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 本研究數(shù)據(jù)利用Microsoft Office Excel 2010、SPSS BASE ver.25.0統(tǒng)計(jì)分析,在α=0.05水平上進(jìn)行差異顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 高效誘變菌株的篩選

    由圖1可見,隨著UV處理時(shí)間的延長(zhǎng),致死率不斷增加,1~2 min致死率急劇上升,4~6 min致死率處于90%左右,6 min時(shí)致死率接近100%。

    參考UV誘變處理的致死率結(jié)果,選擇0.5、1、2 min 等3個(gè)UV照射劑量,進(jìn)行UV-LiCl復(fù)合誘變處理,結(jié)果(表1)發(fā)現(xiàn),經(jīng)紫外照射0.5 min后,致死率伴隨LiCl濃度的增加而出現(xiàn)下降的趨勢(shì),而1 min與2 min UV照射與0.1%~0.6%的LiCl誘變結(jié)合致死率無明顯規(guī)律。根據(jù)致死率,選擇在0.5 min UV和0.1% LiCl處理中挑選菌落。

    共挑取105個(gè)菌落,通過與酵母菌拮抗試驗(yàn)對(duì)比得到20株正突變菌。5次傳代培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)有12株菌株拮抗能力下降。剩余8株菌株依次編號(hào) U-L-1、U-L-2、U-L-3、…、U-L-8,分別測(cè)定2次液體發(fā)酵上清液中環(huán)己酰亞胺的含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘變株U-L-2與U-L-4的產(chǎn)量較高,達(dá)到42 mg/L左右,但傳代后菌株U-L-2生長(zhǎng)緩慢、分生孢子不豐富,最終選擇U-L-4進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn),其活性物質(zhì)產(chǎn)量較野生菌株提高了55.56%(圖2)。

    2.2 突變株U-L-4對(duì)病原菌抑制效果

    對(duì)峙試驗(yàn)結(jié)果表明,突變株U-L-4與野生型CT205均對(duì)芹菜根腐病病原菌尖孢鐮刀菌表現(xiàn)出良好的抑菌效果(圖3),與野生型CT205相比,誘變菌株的抑菌能力顯著提高,對(duì)病原菌的抑菌率達(dá)到70.31%(表2),因此后續(xù)利用誘變菌株U-L-4進(jìn)行固體發(fā)酵及對(duì)芹菜根腐病進(jìn)行防控。

    2.3 突變菌株U-L-4固體發(fā)酵及生物有機(jī)肥制備

    菌株U-L-4種子液按10%接種量接種后 3 d,菌體在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)旺盛,基質(zhì)表面出現(xiàn)白色菌絲體。接種后7 d,基質(zhì)表面的白色變?yōu)榛疑▓D4),基質(zhì)散發(fā)放線菌特有的“土腥味”,鏡檢發(fā)現(xiàn)大量菌絲及少量分生孢子。培養(yǎng)14 d,取樣鏡檢發(fā)現(xiàn)大量分生孢子,然后活菌計(jì)數(shù),U-L-4固體制劑活菌數(shù)達(dá)8.0×108 CFU/g。按10%比例復(fù)合有機(jī)肥制備生物有機(jī)肥。

    2.4 田間試驗(yàn)結(jié)果

    2.4.1 不同處理芹菜生物量及產(chǎn)量的差異 結(jié)果表明,施用U-L-4生物有機(jī)肥及木霉生物有機(jī)肥與對(duì)照相比,芹菜的株高、鮮質(zhì)量等生物量顯著增加(圖5、表3)。對(duì)照處理的芹菜發(fā)病率為27.91%,經(jīng)觀察發(fā)病植株根基部出現(xiàn)一定程度的腐爛且有褐黃色水漬。木霉生物有機(jī)肥處理的芹菜發(fā)病率為6.67%,發(fā)病芹菜根基部出現(xiàn)斷口,無明顯水漬。U-L-4生物有機(jī)肥處理植株沒有出現(xiàn)發(fā)病植株。經(jīng)統(tǒng)計(jì)U-L-4生物有機(jī)肥處理和木霉生物有機(jī)肥處理的芹菜產(chǎn)量分別達(dá)到20 979、15 984 kg/hm2,分別比對(duì)照提高了75.00%、33.33%。

    2.4.2 不同處理芹菜植株根際主要微生物數(shù)量變化 施用U-L-4生物有機(jī)肥及木霉生物有機(jī)肥處理芹菜根際主要微生物數(shù)量發(fā)生顯著變化(表4)。U-L-4生物有機(jī)肥處理后,根際土中細(xì)菌數(shù)量較木霉及對(duì)照處理顯著降低,放線菌數(shù)量較木霉及對(duì)照處理顯著增加。U-L-4生物有機(jī)肥與木霉生物有機(jī)肥處理根際土壤中真菌的數(shù)量變化差異不顯著,但與對(duì)照相比顯著降低。比較各處理根際土壤中尖孢鐮刀菌的數(shù)量變化,發(fā)現(xiàn)U-L-4生物有機(jī)肥及木霉生物有機(jī)肥均能顯著降低尖孢鐮刀菌的數(shù)量,但U-L-4生物有機(jī)肥處理的效果更好,尖孢鐮刀菌的數(shù)量降低一個(gè)數(shù)量級(jí),顯著改善了芹菜根際微生物群落組成。

    3 討論與結(jié)論

    微生物野生菌株效價(jià)低是常見問題,妨礙了功能微生物在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用[12]。誘變選育是篩選高效菌株的重要途徑,常規(guī)誘變方法包括物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變、復(fù)合誘變等[13],其中復(fù)合誘變是使用2種以上或多次使用1種誘變劑的重要誘變手段,通常誘變劑之間具有協(xié)同作用。如 UV-LiCl 復(fù)合誘變, LiCl本身沒有誘變作用, 但通過協(xié)同作用可以提高UV的誘變效果從而可獲得更為高效的誘變菌株。李蕤等對(duì)木霉T6采用UV-LiCl復(fù)合誘變后獲得一株產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶能力顯著提升的突變菌株[14]。在對(duì)微生物誘變選育時(shí)要在合適誘變致死率的處理中挑選誘變菌株進(jìn)行研究,研究發(fā)現(xiàn)在70%~80%的誘變致死率中更易出現(xiàn)正突變菌株[15]。本研究采用UV-LiCl復(fù)合誘變?cè)?0%~80%的誘變致死率中篩選獲得1株正突變菌株U-L-4,其抑菌活性物質(zhì)產(chǎn)量較野生型提高了55.56%。

    芹菜根腐病病原真菌可以在土壤中存活多年,土傳病害一旦發(fā)生,難以有效防治[16]。土地熏蒸是一種化學(xué)防控措施,使用棉隆消毒劑對(duì)土地熏蒸有一定效果,但是在棉隆熏蒸消毒后,土壤中各類微生物數(shù)量急劇下降,對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重破壞[17]。土傳病害的生物防控是促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要措施,開發(fā)使用生防制劑取代化學(xué)藥劑成為當(dāng)前土傳病害的重要防控手段[18-19]。生防菌株可以通過影響植物根際微生物群落結(jié)構(gòu)防控病害的發(fā)生[20]。楊可欣等研究發(fā)現(xiàn),大豆接種芽孢桿菌 8-32 生物制劑處理后,土壤酶活增加,根際微生態(tài)發(fā)生變化,尖孢鐮刀菌數(shù)量顯著降低,大豆根腐病防控效果顯著[21]。王寧等通過高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn),在施用木霉生物制劑制劑后,草莓根際真菌多樣性降低,細(xì)菌多樣性無明顯變化,有害真菌數(shù)量減少,防控草莓土傳病害效果達(dá)到65%[22]。何斐等報(bào)道,魔芋接種放線菌制劑處理后,土傳病害防控效果顯著,根際微生物區(qū)系發(fā)生顯著變化,放線菌數(shù)量增加,有害真菌和細(xì)菌數(shù)量下降,魔芋根際微生物從“真菌型”和“細(xì)菌型”變?yōu)椤胺啪€菌型”[23]。本研究結(jié)果與之相似。目前功能微生物的篩選及生物有機(jī)肥的研發(fā)方興未艾,新型生物有機(jī)肥的應(yīng)用,有利于改良土壤,保護(hù)生態(tài)環(huán)境,提高農(nóng)業(yè)種植水平和農(nóng)作物產(chǎn)品品質(zhì)。

    本研究利用UV-LiCl復(fù)合誘變得到一株優(yōu)良的突變菌株U-L-4。利用其制備的生物有機(jī)肥可有效防控芹菜根腐病,促進(jìn)芹菜生長(zhǎng),提高芹菜產(chǎn)量,并顯著降低根際土壤中病原真菌-尖孢鐮刀菌的數(shù)量,改善了根際生態(tài)環(huán)境,芹菜增產(chǎn)75%。

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