翠冠梨果實采后病原菌分離鑒定及室內(nèi)毒力測定

李樹成，王印寶，趙顯陽，吳 帆，肖劉華，陳 明，陳金印，2，向妙蓮

(1 江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院/江西省果蔬采后處理關(guān)鍵技術(shù)與質(zhì)量安全協(xié)同創(chuàng)新中心/江西省果蔬保鮮與無損檢測重點實驗室，南昌，330045；2 萍鄉(xiāng)學院，江西萍鄉(xiāng)，337055)

翠冠梨PyruspyrifoliaNakai cv. ‘Cuiguan’為薔薇科(Rosaceae)梨屬(Pyrus)植物，具有良好的營養(yǎng)價值和栽培性能[1]，是江西省早熟梨的主要栽培品種。翠冠梨的適宜采收期為7月中旬，此時正處于高溫多雨的盛夏，環(huán)境潮濕悶熱，加之采摘、運輸過程中易摩擦碰撞受損，產(chǎn)生微創(chuàng)口，有利于病菌的侵染，導致果實在貯藏期間發(fā)生軟化腐爛，造成嚴重的經(jīng)濟損失[2]。侵染采后梨果實的病原菌種類多樣，研究報道，酥梨[3]、庫爾勒香梨[4]和白梨[5]等梨的采后病原菌包括葡萄座腔菌Botryosphaeria、擴展青霉菌Penicilliumexpansum、鏈格孢菌Alternariasp.和炭疽菌Colletotrichumfructicola等。

目前，江西地區(qū)翠冠梨果實采后病害的研究較少，本實驗室首次報道了由層出鐮刀菌Fusariumproliferatum[6]和美澳型核果褐腐病菌Moniliniafructicola(另文發(fā)表)引起的翠冠梨果實腐爛病。為繼續(xù)明確引起采后翠冠梨果實腐爛致病菌，本文對江西省翠冠梨采后病害病原菌進行分離鑒定，同時使用不同藥劑對病原菌進行室內(nèi)毒力測定，以期為翠冠梨采后病害的防治提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

翠冠梨果實采摘自江西省峽江縣金坪鄉(xiāng)果園，后貯藏于4～5 ℃冷庫，在貯藏期間采集發(fā)病果實，用于病原菌分離。

基因組DNA快速制備試劑盒：購自上海博彩生物科技有限公司；AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒：購自康寧生命科學有限公司。

供試殺菌劑(原藥)：50%肟菌酯(Trifloxystrobin)、95%粉唑醇(Flutriafol)、95%己唑醇(Hexaconazole)、95%復硝酚鈉(Compound Sodium Nitrophenolate)、95%苯醚甲環(huán)唑(Difenoconazole)、95%惡霉靈(Hymexazol)、96%戊唑醇(Tebuconazole)和25%吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)，由江西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院植物保護系農(nóng)藥實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的分離與純化

參考方中達[7]的方法，翠冠梨病果經(jīng)75%乙醇表面消毒后去除病部果皮，取病健交界處果肉，采用組織分離法分離病菌，再進行單孢純化，置-80 ℃保存，活化后待用。

1.2.2 致病性檢測

梨果實經(jīng)75%乙醇消毒，用無菌接種針刺破果皮形成約3 mm深傷口，注入1.0×106個孢子/mL的懸浮液10 μL，以等量無菌水為對照。將接種梨果實置于28 ℃恒溫箱內(nèi)(濕度95%)，逐日記錄梨果實發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌形態(tài)學鑒定

將已純化的病原菌接種在PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5～7 d，根據(jù)菌落特征、菌絲形態(tài)，分生孢子顏色、大小等，參考真菌鑒定手冊等[8-11]，對采后翠冠梨病原菌進行形態(tài)學鑒定。

1.2.4 病原菌分子生物學鑒定

病原菌DNA的提取。將新鮮菌絲體刮取置于滅菌研缽中，加液氮研磨成粉，用基因組DNA快速制備試劑盒提取待鑒定病原菌基因組DNA，于-20 ℃保存。

擴增引物序列。用真菌通用引物ITS1/ITS4(ITS1，5＇-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3＇；ITS4，5＇-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3＇)擴增菌株的rDNA-ITS序列[12]。

PCR擴增體系與程序。PCR擴增50 μL體系：ITS1(10 pmol/L)0.8 μL；ITS4(10 pmol/L)0.8 μL；DNA模板2 μL；10x PCR buffer 5 μL；ddH2O 36.9 μL；dNTP mix 4 μL；r-Taq 0.5 μL。PCR擴增程序：94 ℃預變性6 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s。30個循環(huán)后72 ℃延伸8 min。PCR完成后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒回收純化，產(chǎn)物由蘇州泓迅生物科技有限公司進行測序。

ITS序列分析。利用DNAstar軟件分析菌株rDNA-ITS測序結(jié)果，登陸NCBI進行同源性比對分析。

1.2.5 室內(nèi)毒力測定

采用生長速率法[13]測定不同藥劑對鏈格孢菌Alternariagaisen和粉紅單端孢菌Trichotheciumroseum菌絲生長的抑制作用。使用無菌水將待測藥劑按有效成分分別配制成所設濃度的母液，按1∶9比例將母液混入溶解冷卻至45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，制成試驗所需濃度的含藥平板，以加等量無菌水作為對照。用直徑6 mm的滅菌打孔器，從菌落邊緣切取菌餅接種至平板中央，每處理3次重復，置于25 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)5～7 d后采用十字交叉法測量菌落直徑。抑菌率計算公式：抑制率 =[(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/(對照組菌落直徑)] ×100%；

采用牛津杯法[14]測定不同藥劑對擴展青霉Penicilliumexpansum的抑制作用。用0.9%氯化鈉溶液配制濃度為1.0×106個孢子/mL的孢子懸浮液，將孢子懸浮液按1∶9比例均勻混入冷卻至45 ℃左右的PDA培養(yǎng)基中，制成含菌平板。在平板中央放置一個直徑8.0 mm的牛津杯，注入200 μL藥液，以等量無菌水作為對照，每個處理重復3次，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。抑菌率計算公式：抑制率=[(處理組抑菌圈平均直徑)/(培養(yǎng)皿直徑-對照組抑菌圈平均直徑)]×100%。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 22.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，應用最小二乘法，建立“質(zhì)量濃度對數(shù)-幾率值”的直線方程，其中因變量(y)為抑菌率換算而成的幾率值，而自變量(x)為試驗藥劑濃度對應的對數(shù)值，并分別得出各供試藥劑的EC50值和其相關(guān)系數(shù)R2。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學鑒定

2.1.1 鏈格孢菌形態(tài)學鑒定

鏈格孢菌在生長初期呈灰白色，后逐漸轉(zhuǎn)為黑褐色，菌絲致密，氣生菌絲豐富，菌落中央質(zhì)地緊實，呈氈狀，凸起且泛白，菌落生長速度為15.6 mm/d(圖1D)。分生孢子棍棒形、卵圓形或梨形，淺褐色至黑褐色，有2～5個隔膜，基部有錐形或柱形短喙，大小約(16.4～28.8)μm ×(4.3～15.6)μm(圖1E)。

2.1.2 擴展青霉菌形態(tài)學鑒定

擴展青霉菌生長迅速，初期菌落菌絲緊密，正面呈白色，背面為黃色至黃褐色，生長后期菌落表面形成粉末狀青綠色霉層，產(chǎn)生大量分生孢子(圖1F)。分生孢子梗無色有帚狀分支，分生孢子單孢無色，球形或卵形，大小為(2.7～3.0)μm ×(3.1～3.5)μm(圖1G)。

2.1.3 粉紅單端孢菌形態(tài)學鑒定

粉紅單端孢菌在生長初期菌落呈白色或淡粉色，菌絲絨毛狀，培養(yǎng)第3 d左右轉(zhuǎn)為粉紅色，產(chǎn)生大量分生孢子使菌落呈現(xiàn)出粉質(zhì)狀(圖1H)。分生孢子單生，無色，倒梨形或長圓形，不等大雙胞，分隔處稍有縊縮，孢子基部有喙狀突出，大小約(8.9～27.5)μm × (6.1～12.2)μm(圖1I)。

2.2 病原菌分子生物學鑒定

用rDNA-ITS引物對分離得到的病原菌的ITS區(qū)進行PCR擴增。將電泳后的條帶凝膠回收，送至蘇州泓迅生物科技有限公司測序，獲得的序列大小分別為566、539和613 bp，將所測得序列提交至NCBI GenBank進行BLAST同源性分析，發(fā)現(xiàn)病原菌分別與鏈格孢菌(基因登錄號EU520123.1)、擴展青霉菌(基因登錄號KT316700.4)及粉紅單端孢菌(基因登錄號KP317992.1)同源性為100%，序列與ITS擴增結(jié)果相同。

2.3 致病性測定

將純化后的鏈格孢菌、擴展青霉菌和粉紅單端孢菌回接至健康梨果實，測定其致病性(圖1)。結(jié)果表明：3種菌株均能引起翠冠梨果實發(fā)病，病部與初分離時病果癥狀一致。再次分離回接發(fā)病病果上的病原菌，得到與接種菌株特征一致的菌株。

注：A、B、C分別為鏈格孢菌、擴展青霉菌、粉紅單端孢菌致病性測定結(jié)果；D、E分別為鏈格孢菌菌落及孢子；F、G為擴展青霉菌菌落及孢子；H、I為粉紅單端孢菌菌落及孢子。

2.4 室內(nèi)毒力測定

2.4.1 不同殺菌劑對鏈格孢菌室內(nèi)毒力測定

試驗結(jié)果看出，不同殺菌劑對鏈格孢菌菌絲生長表現(xiàn)出不同抑制效果。其中95%己唑醇對鏈格孢菌抑制效果最好，EC50值為0.519 μg/mL；95%戊唑醇、95%苯醚甲環(huán)唑、95%復硝酚鈉、95%惡霉靈效果次之，EC50值分別為1.972、2.390、11.106、16.244 μg/mL；50%肟菌酯的抑制效果最差，EC50值為1 197.806 μg/mL。比較毒力回歸方程斜率可知，鏈格孢菌對6種殺菌劑的敏感性依次為：95%己唑醇>95%戊唑醇>95%苯醚甲環(huán)唑>95%復硝酚鈉>95%惡霉靈>50%肟菌酯(見表1)。

表1 不同殺菌劑對鏈格孢菌室內(nèi)毒力測定

2.4.2 不同殺菌劑對粉紅單端孢菌室內(nèi)毒力測定

試驗結(jié)果可以看出，不同殺菌劑對粉紅單端孢菌的抑制效果有比較明顯的差異。6種供試殺菌劑中，95%戊唑醇和95%惡霉靈對粉紅單端孢菌的毒力作用最強，其EC50值分別為2.351、3.393 μg/mL；95%苯醚甲環(huán)唑、95%復硝酚鈉、50%肟菌酯、95%己唑醇的抑制效果次之，EC50值分別為8.041、11.772、14.100、16.442 μg/mL。粉紅單端孢菌對6種殺菌劑的敏感性依次為： 95%戊唑醇>95%惡霉靈> 95%苯醚甲環(huán)唑> 95%復硝酚鈉> 50%肟菌酯>95%己唑醇(見表2)。

表2 不同殺菌劑對粉紅單端孢菌室內(nèi)毒力測定

2.4.3 不同殺菌劑對擴展青霉菌室內(nèi)毒力測定

試驗結(jié)果看出，6種供試殺菌劑對擴展青霉菌的抑制效果差異顯著，EC50值在100 μg/mL以內(nèi)的藥劑為25%吡唑醚菌酯、95%己唑醇、95%戊唑醇；95%苯醚甲環(huán)唑、95%粉唑醇、50%肟菌酯的EC50值均大于100 μg/mL。擴展青霉菌對6種殺菌劑的敏感性依次為：25%吡唑醚菌酯>95%己唑醇> 95%戊唑醇> 95%苯醚甲環(huán)唑> 95%粉唑醇> 50%肟菌酯(見表3)。

表3 不同殺菌劑對擴展青霉菌室內(nèi)毒力測定

3 結(jié)論與討論

多種病原菌的侵染是導致果蔬貯藏期間腐敗變質(zhì)的主要原因，適宜條件下，病原菌侵入果實內(nèi)部大量生長繁殖，掠奪寄主營養(yǎng)并分泌有害代謝物，致使果實腐敗變質(zhì)[15]。近年來，梨果實在貯藏期間發(fā)病愈加嚴重，因此明確引起病害的病原菌種類，對梨采后病害的防治至關(guān)重要。前人研究報道了在不同地區(qū)由鏈格孢菌[16]、擴展青霉菌[17]和粉紅單端孢菌[18]分別引起雪英梨、香梨和早美酥梨果實采后病害。本項目組以江西省峽江縣翠冠梨果實為試驗材料，根據(jù)柯赫氏法則，通過形態(tài)學和分子生物學方法，并進行致病性測定，首次報道了由層出鐮刀菌[6]引起的翠冠梨果實腐爛病以及美澳型核果褐腐病菌(另文發(fā)表)?；诖?，本研究進一步明確了引起采后翠冠梨果實腐爛的病原菌為鏈格孢菌、擴展青霉和粉紅單端孢菌。

江西省梨果實采后病害種類復雜，藥劑防治是有效控制梨果實病害的重要途徑之一。本試驗選用不同殺菌劑對鏈格孢菌、擴展青霉和粉紅單端孢菌進行了室內(nèi)毒力測定。對鏈格孢菌的室內(nèi)毒力測定中， 95%己唑醇、95%戊唑醇、95%苯醚甲環(huán)唑?qū)︽湼矜呔囊种菩Ч詈?，其EC50值分別為0.519、1.972、2.39 μg/mL，與高小寬等[19]的研究結(jié)果一致。6種殺菌劑對粉紅單端孢菌毒力測定顯示，95%戊唑醇、95%惡霉靈的毒力最強，有較好的抑制作用；此外，朱亞偉等研究表明，50%多菌靈、70%甲基托布津?qū)婀麑嵎奂t單端孢菌也有較強的抑制效果[18]。不同殺菌劑對擴展青霉菌的毒力測定表明，25%吡唑醚菌酯、95%己唑醇、95%戊唑醇對其生長抑制作用較明顯；張時馨等[20]把臨床藥物應用到對梨果實采后青霉病的防治中，發(fā)現(xiàn)成本低廉的聯(lián)苯芐唑?qū)U展青霉菌的抑制效果較好，將傳統(tǒng)藥劑開發(fā)成為防控采后病害的新用途。

本文鑒定了引起翠冠梨果實采后病害的3種主要致病菌，并測定了不同殺菌劑對上述病原菌的毒力，為防治翠冠梨果實采后腐爛病提供了一定的理論參考。由于室內(nèi)毒力試驗受多種因素的制約，不同殺菌劑在翠冠梨果實貯藏實踐的防病效果有待后續(xù)試驗進一步驗證。