一種新的檳榔根腐病病原菌鑒定

楊德潔，余鳳玉，牛曉慶，宋薇薇，唐慶華，覃偉權(quán)

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所/海南省檳榔產(chǎn)業(yè)工程研究中心，海南文昌，571339)

檳榔是我國(guó)四大南藥之首，其果、種子、皮、花均可入藥[1]。目前，中國(guó)已躍居為世界第二大檳榔生產(chǎn)國(guó)，而中國(guó)檳榔產(chǎn)量的95%以上都來自海南省[2]。近年來，檳榔病蟲害頻發(fā)，對(duì)海南省檳榔產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展造成嚴(yán)重威脅。受檳榔病蟲害等因素影響，2020年海南省檳榔產(chǎn)量較2019年下降約2.9%，打破了連續(xù)多年檳榔產(chǎn)量持續(xù)增長(zhǎng)的趨勢(shì)[3]。其中檳榔根腐病為害嚴(yán)重，一度成為海南島檳榔主產(chǎn)區(qū)影響檳榔生產(chǎn)的主要障礙之一[4]。引起檳榔根腐病的病原菌種類多樣，目前國(guó)內(nèi)已報(bào)道的檳榔根腐病病原菌包括Phellinusnoxius、Ustulinadeusta、Ganodermalucidum[4-5]，以及鐮刀菌可引起檳榔鐮刀菌根頸腐爛病[6]等。

大部分根腐病菌感染檳榔后都會(huì)引起檳榔根部壞死，地上部葉片變色發(fā)黃或枯死，甚至全株枯死，嚴(yán)重影響檳榔生長(zhǎng)。2019—2020年筆者在海南島東部地區(qū)調(diào)查檳榔根腐病發(fā)現(xiàn)，一種不常見的檳榔根腐病癥狀根部病害。通過采集樣品、組織分離培養(yǎng)、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)觀察等明確該病原菌為可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobromae，并對(duì)該病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行初步研究，以期為該病害發(fā)生規(guī)律探究和綜合防治措施制訂提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株為分離自發(fā)病檳榔根部的菌株，供試植物為中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所“熱研1號(hào)”檳榔苗(3～4片葉)。

1.2 方法

1.2.1 田間樣品采集 2019—2020年調(diào)查中，在海南島瓊海市檳榔種植區(qū)發(fā)現(xiàn)一種與已報(bào)道檳榔根腐病癥狀不同的根部病害，進(jìn)行田間癥狀觀察與記錄后，對(duì)病株整體形態(tài)與根部進(jìn)行拍照，將采集的樣品放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.2 病原菌的分離純化 采用常規(guī)組織分離法對(duì)發(fā)病植株進(jìn)行病原物分離純化。用清水將病根表面泥土沖洗后，再用75%酒精脫脂棉擦洗表面，用無菌刀片在病健交界處切取長(zhǎng)約1.0 cm的病根組織，置于75%酒精中浸泡30 s，用1%NaClO表面消毒3～5 min，無菌水漂洗3次，將其放在無菌濾紙上吸干水分，用無菌刀片去除表皮后切成約2 mm×5 mm的組織塊，然后轉(zhuǎn)移到PDA平板上培養(yǎng)；待長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)接至新鮮PDA平板上培養(yǎng)，多次轉(zhuǎn)接直至菌落形態(tài)一致，最后將純化好的菌落轉(zhuǎn)移到PDA斜面保存待用[7]。

1.2.3 病原菌的致病性測(cè)定 采用柯赫氏法則對(duì)分離純化菌株進(jìn)行致病性測(cè)定。采用蘸根法[8]接種：用滅菌針頭損傷健康檳榔幼苗根部，將損傷的植株于13 g/L菌絲懸浮液中浸泡30 min，無菌濕潤(rùn)脫脂棉包裹后移至無菌塑料盒中，根部遮光培養(yǎng)，以無菌水浸泡30 min作為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。自然光照，定期補(bǔ)充水分并觀察記錄植株發(fā)病狀態(tài)，發(fā)病后對(duì)發(fā)病組織進(jìn)行病原菌分離培養(yǎng)，鑒定再次分離到的病菌性狀是否與原始分離菌相同。

1.2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定 進(jìn)行致病性驗(yàn)證的同時(shí)，將純化菌株接種到PDA平板上，參照Alves等[9]培養(yǎng)條件，分別在全黑暗及全光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)和色澤，測(cè)量菌落直徑，并在顯微視野下觀察分生孢子等形態(tài)特征，并測(cè)量孢子大小。

1.2.5 病原菌的分子學(xué)鑒定 將純化后的菌株28 ℃培養(yǎng)5～7 d后，采用真菌DNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提取DNA。利用rDNA-ITS序列引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)/ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物均委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。50 μL PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR Master Mix 25 μL(北京索萊寶科技有限公司)、引物各2 μL、DNA模板1.5 μL，加去離子水[天根生化科技(北京)有限公司]補(bǔ)足至50 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min，10 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳30 min，PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。測(cè)序所得序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載與待測(cè)菌株同屬的標(biāo)準(zhǔn)菌株ITS序列以及外群標(biāo)準(zhǔn)菌株ITS序列，運(yùn)用MEGA-X軟件進(jìn)行序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(鄰接法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間癥狀

該病原菌主要為害檳榔根部，同時(shí)葉部會(huì)有變色或枯死。發(fā)病初期病根表面發(fā)黑有菌絲纏繞，但無明顯壞死；隨著病菌擴(kuò)展，病根木質(zhì)部逐漸變褐腐爛且易與皮層分離，下部葉片變黃并自下而上、由葉尖向內(nèi)部發(fā)展，最終整株變色或枯死(見圖1)。

圖1 檳榔根腐病發(fā)病植株葉部、根部癥狀(左)和致病性驗(yàn)證的葉部、根部癥狀(右)

2.2 致病性測(cè)定

對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行致病性驗(yàn)證，蘸根7 d后，健康檳榔苗下部葉片從葉尖開始變黃，并逐漸向上擴(kuò)展，根部木質(zhì)部變褐且易與皮層分離，針刺處較為明顯(見圖1)；對(duì)照均未發(fā)病。取發(fā)病植株根部樣品，對(duì)病健交界處組織進(jìn)行分離培養(yǎng)，獲得與最初分離的病原菌一致的菌株。根據(jù)柯赫氏法則，說明分離的病原菌為檳榔根腐病的致病菌。

2.3 病原菌形態(tài)鑒定

該病原菌在PDA平板上生長(zhǎng)迅速，光照和黑暗條件下2～3 d均可長(zhǎng)滿整皿(直徑9 cm)，菌絲發(fā)達(dá)，絨毛狀，菌落邊緣不整齊。光照和黑暗條件下，菌落初期灰白色，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，菌落顏色不斷變深，最后呈灰黑色(見圖2)，顯微觀察發(fā)現(xiàn)菌絲分隔且有分支。黑暗和光照培養(yǎng)菌株有差異，光照培養(yǎng)的菌株培養(yǎng)后期會(huì)產(chǎn)生墊狀子座，而黑暗培養(yǎng)的菌株產(chǎn)生子座數(shù)量極少或不產(chǎn)生子座。將子座內(nèi)的分生孢子器切開，在顯微鏡下觀察，可看到大量未成熟和成熟的分生孢子。未成熟分生孢子為橢圓形或卵形，單孢，顏色淺，細(xì)胞壁較薄，大小為(11.83～17.02) μm×(20.95～30.90) μm；成熟分生孢子為橢圓形或卵形，中間有一分隔(雙孢)，顏色深，細(xì)胞壁厚，大小為(11.36～15.19) μm×(21.45～27.56) μm(見圖3)。這些形態(tài)特點(diǎn)都基本符合可可毛二色孢菌的特征[10]，試驗(yàn)過程中未觀察到其有性階段。

圖2 檳榔根腐病病原菌在PDA培養(yǎng)基上的菌落性狀

圖3 檳榔根腐病病原菌分生孢子器(a)、分生孢子(b)及菌絲(c)形態(tài)特征

2.4 病原菌分子鑒定

將測(cè)序得到的rDNA-ITS序列通過BLAST進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示其與多個(gè)Lasiodiplodiatheobromae菌株的相似度高達(dá)99%以上。為了進(jìn)一步鑒定菌株，我們?cè)贜CBI中下載了10個(gè)Lasiodiplodia屬標(biāo)準(zhǔn)菌株的ITS序列，并將Botryosphaeriadothidea(NR-111146.1)和Botryosphaeriascharifii(NR-111719.1)作為外群，通過MEGA-X軟件進(jìn)行序列比對(duì)與構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[11]。結(jié)果顯示目標(biāo)菌株Q-7-1與Lasiodiplodiatheobromae聚為一類(見圖4)，且具有很高的自舉支持率，從而在系統(tǒng)學(xué)角度證明了Q-7-1為可可毛色二孢菌Lasiodiplodiatheobromae。

圖4 檳榔根腐病病原菌株Q-7-1基于rDNA-ITS序列構(gòu)建的Lasiodiplodia屬系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

本研究通過生物學(xué)與分子學(xué)鑒定方法，最終確定可可毛色二孢菌為導(dǎo)致檳榔根腐病的新病原菌，這是可可毛色二孢菌引起檳榔根腐病的首次報(bào)道。可可毛色二孢菌L．theobromae是子囊菌門(Ascomycota)葡萄座腔菌Botryosphaeriarhodina的無性態(tài)，為多寄主土傳病原真菌，它能引起林木、蔬菜、水果和大田作物等280多種植物田間和貯藏病害[12]，且在不同寄主上癥狀表現(xiàn)不同，包括梢枯、枝枯、根腐、果腐、葉斑、潰瘍、流膠、變色、壞死等，在我國(guó)主要引起葉斑、潰瘍、流膠、梢枯和根腐等癥狀[13]?？煽擅呔鸀槿跫纳穑话阍诩闹髦参镩L(zhǎng)勢(shì)衰弱、樹體產(chǎn)生傷口或外界脅迫時(shí)更易被侵染致病[14]。本研究分離到的病原菌均來自3～4年生幼齡檳榔樹，暫未在壯年大樹根部分離到該病原菌，猜測(cè)可能與幼齡檳榔樹體較弱有關(guān)。

可可毛色二孢菌的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢是否需要光照是目前研究者較為關(guān)注的問題。有學(xué)者認(rèn)為連續(xù)光照24 h條件下更有利于其菌絲生長(zhǎng)[15]，但也有研究認(rèn)為光照對(duì)其菌絲生長(zhǎng)、分生孢子器和分生孢子的形成沒有影響[16]。而本研究發(fā)現(xiàn)光照和黑暗對(duì)其菌絲生長(zhǎng)沒有明顯影響，但連續(xù)24 h光照更有利于其分生孢子器和分生孢子的產(chǎn)生，這與謝紅輝等對(duì)可可毛色二孢菌的研究結(jié)論一致[17]，并且這兩者均分離自發(fā)病根部，是否由于寄主或寄生部位的不同而導(dǎo)致其對(duì)光照需求差異，這需要進(jìn)一步研究。

筆者在調(diào)查過程中還在檳榔根部分離到了一種與可可毛色二孢菌培養(yǎng)性狀極為相似的菌株，經(jīng)鑒定為假可可毛色二孢菌Lasiodiplodiapseudotheobromae，致病性驗(yàn)證試驗(yàn)中其并未引起檳榔植株發(fā)病。這兩株菌分別來自海南的不同市縣，在PDA培養(yǎng)基上菌落形態(tài)幾乎一樣，僅通過肉眼無法區(qū)分。有相關(guān)研究表明，假可可毛色二孢菌可以引起藍(lán)莓、龍眼、橡膠、桂花、蓮霧等多種作物的潰瘍、枝枯及果腐等癥狀[18]，后續(xù)可在兩種菌的區(qū)分方法以及生物學(xué)特性分析上再進(jìn)行相關(guān)深入研究。