生活飲用水水樣保存與運輸條件對菌落總數(shù)檢測的影響

張艷芬，李紅巖，鄭 蓓，于志勇，李 潔

(中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心，中國科學(xué)院飲用水科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，北京 100085)

飲用水微生物污染對人體健康造成威脅，在所有飲用水安全的影響因素中居于首位[1]，通過微生物指標(biāo)的檢測控制水質(zhì)污染是飲用水水質(zhì)安全保障的重要部分[2]，而水樣的采集與運輸是確保微生物指標(biāo)檢測結(jié)果能夠客觀、真實反映水中微生物水平的關(guān)鍵步驟[3-4]。

為保障檢測數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性及可靠性，《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 水樣的采集與保存》(GB/T 5750.2—2006)(以下簡稱《標(biāo)準(zhǔn)方法》)中規(guī)定，用于微生物分析的水樣保存方法為低溫(0～4 ℃)避光保存，保存時間為4 h[5]?！端|(zhì)采樣 水樣的保存和管理技術(shù)規(guī)定》(HJ 493—2009)也規(guī)定了用于微生物分析的水樣保存方法為2～5 ℃冷藏，盡快檢測[6]。然而，實際生產(chǎn)活動中，由于檢測實驗室與采樣地點的距離限制，水樣采集后運輸時長往往超過4 h，無法滿足《標(biāo)準(zhǔn)方法》要求。長距離的運輸和不適宜的保存溫度可能導(dǎo)致微生物代謝活性、生長速率和繁殖狀態(tài)發(fā)生改變[7]，從而導(dǎo)致水中微生物指標(biāo)的檢測結(jié)果不能反映真實水質(zhì)。歐盟《水質(zhì)——微生物分析的抽樣》(ISO 19458∶2006)中推薦，用于微生物指標(biāo)檢測的水樣在(5±3)℃下保存8 h，最大可接受時長為12 h[8]。世界衛(wèi)生組織(WHO)《飲用水水質(zhì)準(zhǔn)則》(第二版)指出，使用冷藏運輸箱運輸?shù)那闆r下，水樣采集與檢測的時間間隔不超過6 h，最長時長不應(yīng)超過24 h[9]。美國《飲用水樣本采集快速指南》建議低于10 ℃以下冷藏，不超過30 h[10]。因此，探索并明確適用于飲用水微生物指標(biāo)檢測的水樣保存條件，對指導(dǎo)飲用水微生物指標(biāo)在實際生產(chǎn)活動中的檢測具有重要的實用價值。

1 試驗材料和方法

1.1 試驗材料和設(shè)備

生化培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，HPS-280)，營養(yǎng)瓊脂(陸橋，北京)，菌落總數(shù)質(zhì)控樣(愛德士，美國)。

1.2 試驗方法

1.2.1 保存溫度和時長對菌落總數(shù)的影響試驗

400 mL龍頭水中添加1支菌落總數(shù)質(zhì)控樣(愛德士，美國，批號：031318-1)作為測試水樣。水樣均分4份，分別于4、15、25 ℃和36 ℃條件下保存。按照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 微生物指標(biāo)》(GB/T 5750.12—2006)中的平皿計數(shù)法分別對水樣保存0、4、8、12 h和24 h的菌落進行總數(shù)測定(樣品數(shù)n=5)[13]。使用的龍頭水總氯含量為0.38 mg/L，在添加質(zhì)控樣前的菌落總數(shù)為(2±0.71)CFU/mL (n=5)。水樣均分為4份時，根據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)方法》要求，每100 mL添加0.8 mg硫代硫酸鈉以去除氯消毒劑的影響。

1.2.2 實際水樣分析試驗

在2019年6月—9月，隨機選取北京市轄區(qū)內(nèi)的出廠水、管網(wǎng)水以及鄉(xiāng)鎮(zhèn)井水為研究對象，分不同批次進行水樣采集。采樣地點距檢測實驗室最遠(yuǎn)距離約79 km，最近距離約3 km，水樣采集后盡快運回實驗室。每個采樣點采集2份水樣，每份水樣5個平行，水樣運輸模式為冷鏈運輸(記錄冷藏運輸箱溫度)和同車常溫運輸(記錄車內(nèi)溫度)，水樣到達實驗室后立即按照《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法 微生物指標(biāo)》(GB/T 5750.12—2006)進行菌落總數(shù)檢測，保存時長的統(tǒng)計原則為采樣開始后至檢測開始前。

1.2.3 統(tǒng)計分析

本文所有統(tǒng)計分析使用PASW Statistics 18軟件。不同保存時長后菌落總數(shù)結(jié)果與0時刻結(jié)果的差異顯著性使用獨立樣本T檢驗分析，不同溫度條件下菌落總數(shù)結(jié)果的差異顯著性使用單因素方差分析，溫度和時長雙因素的主體間效應(yīng)使用雙因素方差分析。實際水樣分析時，不同運輸條件下菌落總數(shù)結(jié)果的差異顯著性使用獨立樣本T檢驗分析。

2 結(jié)果和討論

2.1 保存溫度和時長對菌落總數(shù)的影響

2.1.1 不同保存溫度和時長條件下的菌落總數(shù)結(jié)果

本文給出了一種基于能量均衡樹的無線傳感器網(wǎng)絡(luò)實現(xiàn)方案，實現(xiàn)了低實施成本、低維護量、高自動化的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)程監(jiān)測。利用無線傳感器網(wǎng)絡(luò)的分布式特點，大幅度提高了系統(tǒng)在移動性、便捷性、組網(wǎng)靈活性等方面的綜合功能，在各個領(lǐng)域的應(yīng)用會有很好的發(fā)展前景。

不同保存溫度和時長條件下的菌落總數(shù)結(jié)果如表1所示。所有水樣在0時刻的菌落總數(shù)結(jié)果相近，均值在(81±4)～(85±4)CFU/mL。保存4 h后，各溫度條件下的菌落總數(shù)與初始值相近。8 h和12 h后，4～25 ℃保存條件下的菌落總數(shù)依然與初始值相近，在(75±2)～(88±5)CFU/mL，36 ℃保存條件下的菌落總數(shù)則分別增加至(103±4)CFU/mL和(134±8)CFU/mL。24 h后，4 ℃和15 ℃條件下的菌落總數(shù)依然保持在(75±4)CFU/mL和(89±3)CFU/mL，接近初始值，而25 ℃和36 ℃條件下的菌落總數(shù)與初始值相比已分別增長約11倍和137倍。

表1 不同保存溫度和時長條件下的菌落總數(shù) (平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=5)Tab.1 Total Count of Bacteria Colonies under Different Preservation Temperatures and Time (Mean±Standard Error,n=5)

2.1.2 保存時長和溫度影響的差異顯著性分析

保存時長和保存溫度對菌落總數(shù)結(jié)果影響的差異顯著性分別如圖1和圖2所示。由圖1可知，在4 ℃和15 ℃低溫條件下，水樣保存24 h內(nèi)的菌落總數(shù)結(jié)果均與0 h的初始結(jié)果無顯著差異(P>0.05)；圖2的結(jié)果同樣表明，不同保存時長下，15 ℃的結(jié)果均與4 ℃無顯著差異(P>0.05)，這表明15 ℃和4 ℃均可以在24 h內(nèi)維持飲用水水樣中的菌落總數(shù)在初始采集時的狀態(tài)。

在25 ℃條件下，12 h內(nèi)的菌落總數(shù)結(jié)果與0 h無顯著差異(P>0.05)，而保存24 h后菌落總數(shù)增加了1個數(shù)量級，與0 h存在顯著差異(P<0.05，圖1)；不同時長下溫度影響的差異顯著性分析結(jié)果(圖2)也表明，25 ℃僅在保存時長為24 h時顯著高于4 ℃和15 ℃的結(jié)果(P<0.05)。以上結(jié)果表明在25 ℃室溫條件下飲用水中的細(xì)菌可進行緩慢的繁殖代謝[14-15]，24 h后在數(shù)量上表現(xiàn)出明顯的增加。

注：每組內(nèi)，不同字母表示不同溫度處理之間存在顯著差異(P<0.05)，相同字母表示無顯著差異(P>0.05)；即在組內(nèi)，a與b、b與c、a與c之間存在顯著差異，a與ab、ab與b之間不存在顯著差異圖2 不同保存溫度條件下的菌落總數(shù)Fig.2 Total Counts of Bacteria Colonies under Different Preservation Temperatures

在36 ℃條件下，保存4 h后的檢測結(jié)果與0 h的結(jié)果相比無顯著差異(P>0.05)，但保存8 h后的檢測結(jié)果顯著高于0 h(P<0.05)，12 h和24 h后測定的結(jié)果均與0 h結(jié)果存在極顯著差異(P<0.01和P<0.001)。不同時長下溫度影響的差異顯著性分析也表明，8、12 h和24 h時，36 ℃的結(jié)果均顯著高于4 ℃和15 ℃的結(jié)果(P<0.05，圖2)。這說明水中的細(xì)菌在36 ℃條件下保存時，8 h內(nèi)已進行繁殖[16]，在數(shù)量上顯著高于采集時的初始狀態(tài)。

2.1.3 主體間效應(yīng)檢驗

雙因素方差分析的結(jié)果如表2所示，溫度、時長以及溫度和時長對菌落總數(shù)的P均為0.000，小于0.05。這一結(jié)果表明，在給定顯著水平0.05基礎(chǔ)上，溫度和時長作為單因素均對菌落總數(shù)的測定有顯著影響，同時，保存溫度與時長的交互作用對菌落總數(shù)測定結(jié)果的影響也是顯著的。溫度與時長交互作用的顯著性影響表明，溫度與時長對菌落總數(shù)測定的影響相互依賴。

表2 影響因素的主體間效應(yīng)檢驗Tab.2 Effect Tests of Inter-Subjective Influencing Factors

熱圖作為一種常見的可視化方式，可直觀呈現(xiàn)數(shù)據(jù)之間的差異性。如圖3所示，高溫與長時間保存的共同作用導(dǎo)致菌落總數(shù)與初始狀態(tài)的顯著差異，而高溫短時、低溫長時的保存對測定結(jié)果均無顯著影響，因此，溫度和時長的交互作用是水樣保存條件中不可忽略的因素。

在溫度、時長、溫度與時長的交互作用3個影響因素之間，根據(jù)F的大小(表2)，溫度與時長的交互作用對菌落總數(shù)的影響小于溫度，而溫度的影響小于時長。綜上，在影響微生物指標(biāo)測定的水樣保存條件中，時長是最重要的影響因素，溫度以及溫度與時長的交互作用次之。

注：*為P<0.05；**為P<0.01；***為P<0.001圖3 水樣不同保存條件下菌落總數(shù)的熱圖分析Fig.3 Heatmap Analysis of Total Counts of Bacteria Colonies of Water Samples under Different Preservation Conditions

2.2 實際水樣分析

實際生產(chǎn)中，尤其長距離采集水樣時，由于運輸距離和天氣條件影響，水樣采集后往往無法滿足4 h內(nèi)實驗室檢測的要求。本文調(diào)查了夏季時不同運輸距離的16個樣點采樣后的保存和運輸條件對水樣檢測的影響，檢測結(jié)果如表3所示，所有水樣均為5次平行測定結(jié)果。

由表3可知，保存時間小于4 h的出廠水樣和管網(wǎng)水樣中，冷鏈運輸與同車常溫運輸條件下P大于0.05，即差異不顯著。保存時間在4～8 h的10個水樣，其中8個水樣冷鏈運輸與同車常溫運輸條件下所獲得數(shù)據(jù)差異不顯著。其中，水樣在(35.13±2.61)℃下保存4.23 h后的檢測結(jié)果顯著高于冷藏保存條件，水樣在(32.31 ±1.51)℃下保存7.85 h后的檢測結(jié)果顯著高于冷藏保存條件，而保存時長超過8 h的水樣，其在(31.89±0.54)℃下的結(jié)果也顯著高于冷藏條件，即當(dāng)保存時長超過4 h時，31～36 ℃的高溫條件存在導(dǎo)致微生物指標(biāo)發(fā)生顯著改變的風(fēng)險。

表3 實際水樣驗證試驗 (平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=5)Tab.3 Verification Experiments for Actual Drinking Water Samples (Mean±Standard Error,n=5)

上述結(jié)果表明：保存時長小于4 h的水樣，運輸溫度無顯著影響；保存時長在4～8 h的水樣，建議冷鏈運輸或在25 ℃以下的環(huán)境溫度下保存。這與通過龍頭水添加質(zhì)控樣的保存溫度和時長對菌落總數(shù)影響試驗的結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本文以菌落總數(shù)的檢測為例，綜合研究了生活飲用水水樣保存溫度和保存時長對微生物指標(biāo)檢測的影響，主要結(jié)論如下。

(1)生活飲用水水樣保存溫度、時長均對微生物指標(biāo)測定有顯著影響，且兩者的影響相互依賴，其中時長是最重要的影響因素。

(2)建議根據(jù)運輸時長選擇合適的保存溫度：在4 h內(nèi)檢測的生活飲用水水樣可于環(huán)境溫度下保存；在12 h內(nèi)檢測的生活飲用水水樣需保存在4～25 ℃條件下；超過12 h檢測的生活飲用水水樣需冷藏于4～15 ℃，最長可保存24 h。