高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水中4種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物

楊 穎， 楊創(chuàng)濤， 黃慧星

(廣東粵港供水有限公司， 廣東 深圳 518000)

阿維菌素類(lèi)藥物(avermectins, AVMs)主要來(lái)源于鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物的分離提取，屬于大環(huán)內(nèi)酯雙糖類(lèi)化合物，具有高選擇性和高毒殺蟲(chóng)性，對(duì)各種農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)和動(dòng)物寄生蟲(chóng)等有較好的驅(qū)殺效果，目前作為一種新型的農(nóng)畜兩用藥應(yīng)用較為廣泛[1-2]。然而，該類(lèi)藥物極容易通過(guò)食物鏈富集，會(huì)導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性，當(dāng)前世界衛(wèi)生組織(WHO)以及包括中國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家和地方組織等已將阿維菌素類(lèi)藥物確定為高毒性化合物，并對(duì)其殘留量進(jìn)行了限制[3-4]。水環(huán)境是農(nóng)牧產(chǎn)業(yè)重要的排放受體之一，隨著該類(lèi)藥物用量的不斷增大，人類(lèi)飲水安全的風(fēng)險(xiǎn)隱患也在逐步加劇，因此，加強(qiáng)對(duì)水環(huán)境中阿維菌素類(lèi)藥物的監(jiān)測(cè)是十分有必要的。

阿維菌素類(lèi)藥物具有高分子量，較難氣化，目前主要檢測(cè)方法是液相色譜-光譜法(熒光法、紫外法)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，其中紫外法靈敏度低，干擾影響因素多，熒光法涉及衍生化處理，操作復(fù)雜，而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有高選擇性和高靈敏度，目前應(yīng)用日益廣泛[5-6]。當(dāng)前，我國(guó)已出臺(tái)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于飼料、糧食、蔬菜、肉禽等食品中阿維菌素類(lèi)藥物檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法[7-8]，但水質(zhì)相關(guān)的檢測(cè)方法則較為少見(jiàn)。筆者采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，同時(shí)測(cè)定水中阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素，對(duì)基質(zhì)相對(duì)簡(jiǎn)單的水質(zhì)樣品，僅需簡(jiǎn)單的固相萃取處理即可上機(jī)檢測(cè)，測(cè)定下限可達(dá)0.60～0.80 μg/L，靈敏度高，抗干擾能力強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)這4種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的快速、準(zhǔn)確、高靈敏度檢測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(Waters OA Acquity UPLC TQD MS/MS)；硅膠顆粒色譜柱(Waters ACQUITY UPLC HSS T3：50×2.1 mm,1.8 μm)；氟苯基色譜柱(Waters ACQUITY UPLC CSH：50×2.1 mm,1.7 μm)；亞乙基橋雜化顆粒色譜柱(Waters ACQUITY UPLC BEH C18：50×2.1 mm,1.7 μm)；針頭式過(guò)濾器(PTFE，0.45 μm)。

阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素有證標(biāo)準(zhǔn)溶液，100 mg/L，甲醇介質(zhì)；乙腈、甲酸、醋酸銨，色譜純。

1.2 樣品前處理

對(duì)于相對(duì)清潔的水樣，直接取上清液進(jìn)行固相萃??；對(duì)于渾濁水樣，預(yù)先經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后，再進(jìn)行固相萃取。

固相萃取步驟如下：依次用3 mL乙腈、10 mL水活化固相萃取小柱(Shimadzu InertSep PLS-3 PLS-3)；取20 mL清潔水樣，添加1%(體積比)乙腈，緩慢過(guò)柱后抽干小柱；然后依次使用0.5 mL乙腈進(jìn)行2次洗脫；合并2次洗脫液后用乙腈定容至1.0 mL，然后添加1.0 mL水配制成(1+1，體積比)乙腈水溶液，混勻后轉(zhuǎn)移入棕色進(jìn)樣瓶中待測(cè)。

1.3 色譜條件

采用Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50×2.1 mm，1.8 μm)，柱溫為35℃；以(0.05 mmol/L乙酸銨+0.1 %甲酸，體積比)水溶液為流動(dòng)A相，以(0.1 %甲酸，體積比)乙腈為流動(dòng)B相；進(jìn)樣體積為10 μL；采用梯度洗脫方式，梯度程序見(jiàn)表1。

表1 液相色譜流動(dòng)相梯度洗脫程序

1.4 質(zhì)譜條件

離子源：ESI，負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓：1.00 kV；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流量：600 L/h；反吹氣流量：20 L/h；多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式(MRM)，具體條件見(jiàn)表2。

表2 多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件

注：帶*的為定量離子對(duì)，對(duì)于不同質(zhì)譜儀器，參數(shù)可能存在差異，測(cè)定前應(yīng)將質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化到最佳。

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取柱的選擇

實(shí)驗(yàn)選擇了Shimadzu GL WondaSep系列的C18、Shimadzu InertSep系列的PLS-3、Waters Oasis系列的HLB等3種不同材質(zhì)的固相萃取小柱，配制濃度約為5 μg/L的樣品進(jìn)行富集萃取效果研究。

回收率結(jié)果表明，PLS-3小柱的效果明顯優(yōu)于C18和HLB小柱，使用PLS-3小柱萃取后4種目標(biāo)藥物的回收率都要高于其他2種小柱近2倍。因此，選定Shimadzu InertSep系列的PLS-3作為固相萃取小柱。

2.2 色譜柱的選擇

實(shí)驗(yàn)研究了Waters ACQUITY UPLC HSS T3、Waters ACQUITY UPLC CSH Fluoro-Phenyl和Waters ACQUITY UPLC BEH C18 這3種不同色譜分析柱對(duì)4種目標(biāo)化合物的分離效果。

結(jié)果表明，CSH色譜柱無(wú)法將4種目標(biāo)物分離，且靈敏度偏低；BEH C18和HSS T3可以較好地將4種目標(biāo)物分離，且BEH C18可獲取更高的靈敏度。因此，選定Waters ACQUITY UPLC BEH C18作為色譜分析柱。

2.3 進(jìn)樣樣品基質(zhì)的選擇

實(shí)驗(yàn)對(duì)比了純水、(1+1，體積比)乙腈水和純乙腈3種進(jìn)樣基質(zhì)條件下的樣品響應(yīng)靈敏度。結(jié)果表明，以(1+1，體積比)乙腈水溶液作為進(jìn)樣樣品基質(zhì)有最高的靈敏度響應(yīng)，純水基質(zhì)下幾乎沒(méi)有響應(yīng)。因此，選定(1+1，體積比)乙腈水作為進(jìn)樣樣品基質(zhì)，該條件下樣品經(jīng)固相萃取后無(wú)需氮吹，可直接用乙腈和水定容，也提升了檢測(cè)效率。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)中，以(0.05 mmol/L乙酸銨+0.1 %甲酸，體積比)水溶液和(0.1 %甲酸，體積比)乙腈為流動(dòng)相，采用電噴霧離子源(ESI+)，對(duì)4種目標(biāo)化合物的質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。在確定各化合物的母離子后，采用子離子掃描方式對(duì)子離子進(jìn)行優(yōu)化選擇，確定了定量離子和輔助定性離子對(duì)。通過(guò)優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、透鏡電壓、碰撞能量及質(zhì)譜分辨率等質(zhì)譜參數(shù)，使3種目標(biāo)化合物信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到最佳。然后，進(jìn)一步對(duì)離子源溫度、脫溶劑氣溫度及流量、錐孔反吹氣流量進(jìn)行優(yōu)化，使每種化合物的離子化效率達(dá)到最佳，最終確定目標(biāo)化合物的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)條件，見(jiàn)表2。

2.5 目標(biāo)物總離子流圖

在實(shí)驗(yàn)選定的液相色譜和質(zhì)譜條件下，4種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物(濃度均為50.0 μg/L) 都實(shí)現(xiàn)了有效分離，響應(yīng)值良好，見(jiàn)圖1。

圖1 4種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的總離子流圖

2.6 方法性能指標(biāo)

2.6.1 線性關(guān)系、檢出限和測(cè)定下限

采用經(jīng)優(yōu)化的分析條件，對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照《環(huán)境監(jiān)測(cè)分析方法標(biāo)準(zhǔn)制修訂技術(shù)導(dǎo)則》(HJ 168—2010)對(duì)方法檢出限測(cè)定的要求，采用低濃度空白加標(biāo)水樣(n=7)經(jīng)固相萃取富集后上機(jī)測(cè)定，根據(jù)分析結(jié)果計(jì)算其標(biāo)準(zhǔn)偏差SD，檢出限MDL=3.143×SD，定量限為檢出限的4 倍。從表3可以看出，方法的線性相關(guān)性好，目標(biāo)物檢出限在0.10～0.20 μg/L，測(cè)定下限在0.40～0.80 μg/L，可滿足水體低濃度樣品的檢測(cè)需求。

表3 4種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的線性關(guān)系、檢出限和定量限

2.6.2 精密度和準(zhǔn)確度

對(duì)地表水、飲用水2種不同類(lèi)型的實(shí)際水樣中目標(biāo)化合物的濃度進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果均為未檢出。同時(shí)，在上述2種類(lèi)型樣品中分別加入不同濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，進(jìn)行低、中濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度分別平行配制7份樣品，同時(shí)計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和平均加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，平行樣間相對(duì)偏差在5.6%～12.9%，水樣的加標(biāo)回收率在84.6%～126%，方法精密度和準(zhǔn)確度良好。

3 結(jié)論

建立了超高效液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定水中阿維菌素、伊維菌素、多拉菌素、乙酰氨基阿維菌素等4種大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的分析方法。該方法的樣品固相萃取前處理簡(jiǎn)單，有機(jī)溶劑用量少，環(huán)境友好，檢出限、精密度和準(zhǔn)確度令人滿意，能夠滿足水體中大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)藥物的檢測(cè)要求。