甜櫻桃砧木吉塞拉6號組織培養(yǎng)體系優(yōu)化

廖益民，沈國正，駱慧楓，黃康康，裴嘉博，郗篤雋，張琛，阮若昕，劉輝*

(1.建德市農業(yè)技術推廣中心，浙江 建德 311600；2.杭州市農業(yè)科學研究院 園藝研究所，浙江 杭州 310024)

甜櫻桃(PrunusaviumL.)是落葉果樹中繼中國櫻桃之后成熟最早的水果，其顏色艷麗、風味濃郁、綠色健康，深受我國消費者青睞[1]。果實品質、產量、植株抗性與砧木密切相關，甜櫻桃矮化砧木吉塞拉(Gisela)由德國育成，為酸櫻桃(Prununcerasus)和灰毛葉櫻桃(Prununcanescens)雜交培育而成。其中吉塞拉6號具有較好的矮化性、豐產性和抗逆性，與大多數(shù)甜櫻桃品種具有較強的親和性[2]。與吉塞拉5號相比，吉塞拉6號長勢更強，“小腳病”較弱；與吉塞拉12號相比，吉塞拉6號矮化性更好，適宜于南方暖濕地區(qū)栽培。

吉塞拉6號為3倍體，主要采用扦插繁殖，生根率為80%[3]。組織培養(yǎng)技術可以優(yōu)質高效地實現(xiàn)種苗的快速繁殖，為了加快砧木的繁殖速率，打破季節(jié)限制，提高苗木整齊性，本研究以吉塞拉6號為實驗材料，采用組織培養(yǎng)的繁殖方式，分析影響組培苗生根的關鍵因子，得出吉塞拉6號適宜的培養(yǎng)體系，為實現(xiàn)工廠化、穩(wěn)定化育苗提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

吉塞拉6號外植體材料來自杭州市農業(yè)科學研究院種質資源圃。

1.2 方法

1.2.1 無菌系建立

在晴朗天氣，選擇長勢良好、無病蟲害的半木質化枝條，除去葉片，剪成1 cm左右的帶芽莖段，將莖段用肥皂水振蕩沖洗10 min，用流動自來水沖洗60 min，放置超凈臺，用滅菌的濾紙吸干水分，轉移到滅菌的空瓶中，加入75%乙醇浸泡45 s后，加入0.1%的HgCl2溶液分別振蕩滅菌8 min和10 min，用無菌水沖洗4遍，切下芽尖，接種在初代培養(yǎng)基上：MS(MS+6 g·L-1瓊脂)+30 g·L-1蔗糖+0.2 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-16-BA，pH 5.8，置于培養(yǎng)室培養(yǎng)(圖1中A～D)。培養(yǎng)條件為光照周期10 h/14 h，光照強度2 000 lx，溫度24 ℃。每個處理10瓶，重復3遍，接種10 d后統(tǒng)計污染率。

1.2.2 增殖培養(yǎng)

出芽后將長勢健壯的嫩芽切成1 cm左右小段，轉移至增殖培養(yǎng)基中(圖1中E～F)。選取文獻中最適宜的2種培養(yǎng)基類型，分別為(A1)MS+0.1 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8；(A2)MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8[4-5]。每個處理10瓶，重復3次，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計成活情況和增殖情況，培養(yǎng)條件同上。

1.2.3 生根培養(yǎng)

將增殖后的叢生芽切成單芽，將1.5 cm以上的單芽接種至生根培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基為1/2 MS(1/2 MS+6 g·L-1瓊脂)+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1葡萄糖+0.1% Ac，pH 5.8。分別遮光培養(yǎng)7、11、15 d后光照培養(yǎng)(B1-B3)，每個處理20瓶，重復3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根情況。

將增殖后的叢生芽切成單芽，將1.5 cm以上的單芽接種至生根培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基分別為(C1)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1葡萄糖+0.1% Ac，pH 5.8；(C2)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1葡萄糖+0.1% Ac，pH 5.8。遮光培養(yǎng)15 d后光照培養(yǎng)，每個處理20瓶，重復3次，培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計生根情況。

將增殖后的叢生芽切成單芽，將1.5 cm以上的單芽接種至生根培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基分別為(D1)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+0.1% Ac，pH 5.8；(D2)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖+0.05% Ac，pH 5.8；(D3)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8。遮光培養(yǎng)15 d后光照培養(yǎng)，每個處理20瓶，重復3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根情況。

將增殖后的叢生芽切成單芽，將1.5 cm以上的單芽接種至生根培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基分別為(E1)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.1 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8；(E2)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.2 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8；(E3)1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8；遮光培養(yǎng)15 d后光照培養(yǎng)，每個處理20瓶，重復3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根情況。

將增殖后的叢生芽切成單芽，將1.5 cm以上的單芽插至不同的濕潤的培養(yǎng)介質中，處理如下：(F1)椰糠；(F2)草炭；(F3)珍珠巖；(F4)河沙。遮光培養(yǎng)15 d后光照培養(yǎng)，每個處理5瓶，重復3次，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計生根情況。

1.2.4 組培苗馴化移栽

將組培苗移至溫室中，自然光下馴化10 d，取出幼苗，洗凈根上的培養(yǎng)基，800倍多菌靈溶液速蘸后，種植到穴盤中，透明育苗蓋覆蓋7 d后揭開。組培苗長出7片成熟新葉片后移栽至育苗床中(圖1中K～L)。

A～D—芽尖培養(yǎng)；E～F—增殖培養(yǎng)；G～J—生根培養(yǎng);K～L組培苗移栽至育苗床中。

2 結果與分析

2.1 不同滅菌時間對外植體成活率的影響

采用HgCl2滅菌外植體成活率較高，污染率較低，主要為真菌性污染。不同滅菌時間對吉塞拉6號外植體成活率有一定的影響，滅菌時間為8 min時，出芽率較高，達93.9%，污染率也較高，為18.2%。滅菌時間為10 min時，出芽率為89.4%，輕微褐化，污染率為9.1%(表1)。說明滅菌時間越長，污染率越低，出芽率也降低，出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

表1 不同滅菌時間對外植體成活率的影響

2.2 不同培養(yǎng)基對增殖的影響

選取2種最適宜的增殖培養(yǎng)基進行試驗。結果表明，不同激素誘導和增殖效果不同。增殖培養(yǎng)20 d后，處理1增殖倍數(shù)為3.8，芽平均高度為2.2 cm；處理2增殖倍數(shù)為4.7，芽平均高度為2.5 cm(表2)。說明處理2培養(yǎng)效果優(yōu)于處理1，更適宜作為增殖培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)基對增殖的影響

2.3 不同遮光時間對生根的影響

由表3可見，吉塞拉6號組培苗生根率較低，同時，遮光時間不同對生根率和組培苗有一定影響。隨著遮光時間增加，生根率增加，遮光時間為15 d時，生根率為36.7%，根數(shù)較少，細短且彎曲(圖2中A)。

表3 不同遮光時時間對生根的影響

2.4 不同碳源種類對生根的影響

組織培養(yǎng)中碳源的種類通常為蔗糖和葡萄糖，試驗表明，不同碳源類型對吉塞拉6號的生根作用影響顯著(表4)，其中以蔗糖為碳源的培養(yǎng)基生根率為47.5%，平均根長為3.2 cm，生根效果優(yōu)于葡萄糖。但是莖葉仍然短小，生根效率不高。

表4 不同碳源種類對生根的影響

2.5 不同活性炭含量對生根的影響

有研究表明活性炭具有吸附有害代謝物質，提供黑暗環(huán)境的作用，能夠抑制褐化現(xiàn)象，促進成苗率。試驗結果表明，活性炭含量為0.1%時，生根率為29.1%(表5)。隨著活性炭含量減少，生根率增加，活性炭含量為0時，生根率顯著提高，高達76.7%，平均根數(shù)增加，根粗長，莖葉健壯。

表5 不同活性炭含量對生根的影響

2.6 不同激素濃度對生根的影響

由表6可知，激素濃度對組培苗生長具有較大的影響，其中NAA濃度為0.1 mg·L-1時，生根率為88.24%，叢枝數(shù)較多(圖2中D)。當NAA濃度為0.3 mg·L-1時，第5 d開始生根(圖1中G)，第12 d后生根率達到100%(圖1中H)，28 d后根系白色、粗壯(圖1中K～L)；平均根數(shù)為7.3 cm，平均根長為6.3 cm；莖段長5.9 cm，莖葉健壯，叢枝率減少。

表6 不同激素濃度對生根的影響

2.7 不同培養(yǎng)介質對扦插生根的影響

為提高組培苗韌性，采用不同介質進行扦插生根。試驗結果表明，以椰糠和草炭為培養(yǎng)介質的生根率最高，為75%(表7)。其中以椰糠為介質的組培苗根系多，平均根數(shù)為7.5條，平均根長為5.34 cm，莖葉健壯。以珍珠巖為介質的組培苗根粗短，以河沙為介質的組培苗根系分叉較多，長度均勻，但是葉片存在斑狀焦枯(圖2中E～H)。

表7 不同培養(yǎng)介質對扦插生根的影響

A—遮光時間15 d；B—碳源 蔗糖；C—活性炭0.00%；D—激素濃度0.3 mg·L-1；E～H—不同基質。

3 小結與討論

試驗表明，吉塞拉6號組培快繁最佳滅菌方法為75%乙醇滅菌滅菌30 s、0.1% HgCl2滅菌10 min，初代培養(yǎng)基為MS+0.2 mg·L-1IBA+0.5 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8，最佳增殖培養(yǎng)基為MS+0.1 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.3 mg·L-1IBA+0.3 mg·L-1NAA+30 g·L-1蔗糖，pH 5.8。

培養(yǎng)基類型、植物生長調節(jié)劑含量、培養(yǎng)環(huán)境等對組織培養(yǎng)都有重要的影響[6]。在南方地區(qū)，吉塞拉6號組培苗生根困難[7]。部分研究表明培養(yǎng)基中加入活性炭能夠創(chuàng)造黑暗的環(huán)境，促使根系分泌生長素，有利于根系生長[5,8]。在本研究中，活性炭是制約吉塞拉6號生根的關鍵因素?；钚蕴烤哂蟹沁x擇性吸附作用，它在吸附有害物質的同時，還會吸收培養(yǎng)基中的生長調節(jié)劑和營養(yǎng)物質，影響了組培苗的生長。在櫻花組培中，IBA和NAA的配合使用優(yōu)于單獨使用，生根率可達100%[9]。本研究結果證明，在吉塞拉6號組培中，IBA和NAA配合使用能夠提高生根率，效果顯著。組培苗在培養(yǎng)基中生根率高，根系發(fā)達，但存在株與株間根系纏繞，根系較脆，缺乏韌性，移栽時不易分離，損傷較大，易長霉菌。直接采用栽培基質生根可以減少損失，提高移栽成活率。以椰糠和草炭為介質，能增強根系韌性，提高移栽成活率，生根率有待于進一步提高。