苦參堿對(duì)人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞系TPC-1增殖和遷移的影響

傅松波，馬承旭，井高靜，趙 楠，湯旭磊*，牟軍勤，常寅龍

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院 內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州市城關(guān)區(qū)人民醫(yī)院 內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730030)

乳頭狀甲狀腺癌(papillary thyroid cancer，PTC)10～15年的存活率達(dá)到85%，預(yù)后良好。然而，部分乳頭狀甲狀腺癌患者會(huì)發(fā)展到侵入鄰近組織(如淋巴結(jié))，預(yù)后較差[1]。因此，闡明部分乳頭狀甲狀腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制和開(kāi)發(fā)具有診斷及判斷乳頭狀甲狀腺癌預(yù)后的分子標(biāo)志物具有重要意義。miRNA表達(dá)譜揭示差異表達(dá)的miR-182-5p和乳頭狀甲狀腺癌的臨床復(fù)發(fā)密切相關(guān)[2]，miR-182的表達(dá)水平比正常甲狀腺組織增加3倍[3]，其在乳頭狀甲狀腺癌癌變中起致癌作用。

苦參堿(matrine)具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期停止[4]、增加腫瘤細(xì)胞的凋亡、降低腫瘤細(xì)胞的增殖[5]和遷移[6]等作用，具有抗多種腫瘤細(xì)胞活性。本研究表明苦參堿顯著的降低TPC-1中miR-182-5p的表達(dá)，但是，苦參堿治療乳頭狀甲狀腺癌的分子機(jī)制是否與miR-182-5p相關(guān)尚未報(bào)道，本文將探討苦參堿降低miR-182-5p的表達(dá)對(duì)乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞系增殖和遷移的影響，為臨床應(yīng)用苦參堿治療乳頭狀甲狀腺癌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及細(xì)胞

苦參堿(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶和血清(Gibco公司)；CCK-8試劑盒(北京同仁生物科技有限公司)；Transwell小室(康寧生物科技有限公司)；EndoFectin-Max 轉(zhuǎn)染試劑、miR-182-5p mimics及miR-182-5p抑制劑(GeneCopoeia公司)，E-cadherin、N-cadherin和vinmentin抗體(Abcam公司)。人甲狀腺正常細(xì)胞系Nthy-ori 3-1和人甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞系TPC-1(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分組及處理：分為兩大組，1)藥物處理組(分別用0、0.25、0.5和1 mg/mL的苦參堿處理TPC-1細(xì)胞)；2)轉(zhuǎn)染組(將TPC-1細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁后行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)并分為抑制劑對(duì)照組(inhibitor-NC)、miR-182-5p的抑制劑組(inhibitor)、模擬物對(duì)照組(mimics-NC)和miR-182-5p 模擬物組(miR-182-5p mimics)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖：將轉(zhuǎn)染組(6×103個(gè)/孔)的TPC-1細(xì)胞接種于96孔板，其中mimics-NC和miR-182-5p mimics組的TPC-1貼壁后加入或者不加入0.5 mg/mL的苦參堿，于37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)0、24、48及72 h,加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育4 h，讀取波長(zhǎng)450 nm處各組細(xì)胞的吸光度值。

1.2.3 采用Transwell小室法檢測(cè)TPC-1細(xì)胞的遷移：將8×103個(gè)/室的轉(zhuǎn)染組的TPC-1細(xì)胞接種于小室上面，每室約100 μL，下面添加DMEM培養(yǎng)基，其中mimics-NC和miR-182-5p mimics組的TPC-1細(xì)胞貼壁后，向小室下面添加或者不添加0.5 mg/mL的苦參堿，置37 ℃、孵育48 h，取出小室，置24孔板，PBS漂洗2次，固定10 min，染色15 min，觀察TPC-1細(xì)胞的遷移并計(jì)數(shù)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-182-5p、E-cadherin、N-cadherin和vinmentin基因表達(dá)：從上述各組細(xì)胞中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用Bio-Rad CFX Manager3.1 PCR儀擴(kuò)增，分析miR-182-5p、E-cadherin、N-cadherin和vinmentin的表達(dá)，采用2-ΔΔCt方法分析目的基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.5 采用Western blot檢測(cè)vinmentin、E-cadherin和N-cadherin的蛋白表達(dá)：提取各處理組總蛋白，SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，用一抗二抗標(biāo)記，檢測(cè)分離的目的蛋白條帶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-182-5p在TPC-1細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)水平

TPC-1細(xì)胞中miR-182-5p表達(dá)量顯著地高于NT組(P<0.01)。

2.2 miR-182-5p的下調(diào)抑制TPC-1細(xì)胞的增殖及遷移

在TPC-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-182-5p inhibitor，24、48和72 h后，inhibitor組TPC-1細(xì)胞A450 nm吸光度值均顯著地低于inhibitor-NC組；inhibitor組遷移的TPC-1細(xì)胞明顯少于inhibitor-NC組(P<0.01)(圖1)。

*P<0.01 compared with inhibitor-NC圖1 miR-182-5p對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖和遷移的影響Fig 1 Effect of miR-182-5p on proliferation and migration of TPC-1 n=5 or n=3)

2.3 苦參堿降低了miR-182-5p表達(dá)和TPC-1細(xì)胞的增殖、遷移

與control組相比，劑量為0.5和1 mg/mL的苦參堿均抑制TPC-1細(xì)胞中miR-182-5p表達(dá)(P<0.01)，且0.5 mg/mL苦參堿的抑制效果最好；與control組相比，0.5 mg/mL苦參堿在24、48和72 h均顯著地抑制TPC-1細(xì)胞增殖；0.5 mg/mL的苦參堿治療TPC-1細(xì)胞，48 h后，遷移的TPC-1細(xì)胞明顯少于control組(P<0.01)(圖2)。

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group圖2 苦參堿影響了TPC-1細(xì)胞中miR-182-5p的表達(dá)、增殖和遷移Fig 2 Effect of matrine on miR-182-5p level and proliferation and migration of TPC-1 n=5 or n=3)

2.4 TPC-1細(xì)胞系中miR-182-5p的上調(diào)降低了苦參堿對(duì)增殖和遷移的抑制作用

與mimics-NC相比，mimics-NC+苦參堿組TPC-1細(xì)胞A450 nm吸光度值顯著地降低(P<0.01)；與mimics-NC+苦參堿組相比，miR-182-5p mimics+苦參堿組A450 nm處吸光度顯著地升高(P<0.01)。與mimics-NC相比，mimics-NC+苦參堿組穿透小室TPC-1細(xì)胞數(shù)量明顯減少(P<0.01)；與mimics-NC+苦參堿組相比，miR-182-5p mimics+苦參堿組穿透小室TPC-1細(xì)胞數(shù)量明顯增多(P<0.01)(圖3)。

*P<0.01 compared with mimics-NC group；#P<0.01 compared with mimics-NC+matrine group圖3 TPC-1細(xì)胞中miR-182-5p的上調(diào)對(duì)苦參堿抑制效果的影響Fig 3 Effect of matrine on proliferation and migration of TPC-1 cells when miR-182-5p over-expression

2.5 miR-182-5p的上調(diào)降低了苦參堿對(duì)Vinmentin和N-cadherin的抑制、對(duì)E-cadherin表達(dá)的促進(jìn)作用

在TPC-1細(xì)胞中，與mimics-NC組相比，mimic-NC+matrine組Vvinmentin和N-cadherin的蛋白表達(dá)明顯降低、E-cadherin的蛋白表達(dá)升高；與mimic-NC+matrine組相比，miR-182-5p-mimic+matrine組vinmentin和N-cadherin的表達(dá)水平上升、E-cadherin的蛋白表達(dá)水平降低(圖4)。

A.mimic-NC;B.miR-182-5P-mimic;C.mimic-NC+matrine;D.miR-182-5P-mimic+matrine圖4 miR-182-5p的過(guò)表達(dá)降低了苦參堿對(duì)vinmentin、N-cadherin和E-cadherin的調(diào)節(jié)作用Fig 4 Over-expression of miR-182-5p abolished the matrine-induced the decrease in N-cadherin and vinmentin protein expression as well as the increase in E-cadherin protein expression

在TPC-1細(xì)胞系中，與mimics-NC相比，mimic-NC+matrine組N-cadherin表達(dá)量降低(P<0.05)、E-cadherin表達(dá)增加(P<0.01)；與mimic-NC+matrine組相比，miR-182-5p-mimic+matrine組N-cadherin基因表達(dá)量顯著地增加、E-cadherin基因表達(dá)極顯著地降低(P<0.01)?？鄥A對(duì)vinmentin表達(dá)模式的調(diào)節(jié)作用與N-cadherin一致(表1)。

表1 miR-182-5p的過(guò)表達(dá)降低了苦參堿對(duì)TPC-1細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin 和 vinmentin的影響Table 1 Over-expression of miR-182-5p abolishes the matrine-induced the decrease of N-cadherin and vinmentin gene expression as well as the increase of E-cadherin gene n=3)

3 討論

乳頭狀甲狀腺癌在生物學(xué)上屬于“惰性腫瘤”，但部分甲狀腺癌易發(fā)展為侵襲性。甲狀腺癌細(xì)胞惡性增殖和獲得遷移表型是一個(gè)未受到調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。miRNA既可以促進(jìn)癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移也可以抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，在調(diào)控甲狀腺癌細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等生物學(xué)行為中發(fā)揮雙重角色[7]。本研究結(jié)果顯示：在TPC-1細(xì)胞系中，miR-182-5p的表達(dá)顯著增加，且抑制miR-182-5p的表達(dá)降低了TPC-1細(xì)胞的增殖和遷移，提示miR-182-5p具有導(dǎo)致人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的能力。

苦參堿是一種廣泛應(yīng)用的抗腫瘤藥物，能抑制甲狀腺癌細(xì)胞的惡性病理行為(抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、腫瘤組織侵襲及組織內(nèi)新血管生成等)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[8-10]，我們研究用劑量為0.5和1 mg/mL的苦參堿治療TPC-1細(xì)胞，表明苦參堿的劑量為0.5 mg/mL時(shí)明顯地抑制了miR-182-5p的表達(dá)，同時(shí)降低了TPC-1細(xì)胞系的增殖和遷移，過(guò)表達(dá)TPC-1細(xì)胞中miR-182-5p，苦參堿的抑制效果被降低。提示苦參堿通過(guò)降低TPC-1細(xì)胞中miR-182-5p發(fā)揮治療乳頭狀甲狀腺癌的作用。

人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移與甲狀腺癌臨床復(fù)發(fā)事件密切相關(guān)，癌細(xì)胞經(jīng)歷了上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，獲得了遷移表型，以E-cadherin的下調(diào)和N-cadherin的上調(diào)為分子基礎(chǔ)，為甲狀腺癌細(xì)胞具有侵襲和轉(zhuǎn)移的能力提供了必要的條件[11]。本研究發(fā)現(xiàn)苦參堿逆轉(zhuǎn)了TPC-1細(xì)胞中E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)模式，從而降低TPC-1細(xì)胞獲得遷移表型的能力，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。雖然苦參堿能夠調(diào)節(jié)上述分子的表達(dá)，但這些變化的分子哪些分子可能是miR-182-5p的潛在靶標(biāo)還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)(例如熒光素酶報(bào)告試驗(yàn))證實(shí)。