CRISPR-Cas9技術(shù)原理及其在豬的應(yīng)用研究新進(jìn)展

房元杰，張曉愛，魏文康*，劉春朋

（1．仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院動物科技學(xué)院，廣東廣州510225；2．廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣東廣州510640）

基因編輯（gene editing，Ge）是能夠更準(zhǔn)確地改變生物基因組內(nèi)特定目標(biāo)基因的新基因工程技術(shù)，指人為操作基因組的特定堿基插入、缺失或替換的行為，也被稱為基因組編輯。20世紀(jì)80年代，Thomas等[1]將外源DNA序列整合到哺乳類動物基因組的特定部位，成功修復(fù)堿基變異，并刪除DNA序列，由此開啟人工改變生物基因組的歷程?，F(xiàn)在，基因編輯技術(shù)作為重要工具在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。

傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)依賴機(jī)體自發(fā)的同源重組修復(fù)機(jī)制，打靶效率低、操作煩瑣[2]，需要對隨機(jī)集成的基因組進(jìn)行解決、置換或變更。因此，傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)無法滿足現(xiàn)階段的需求。集群規(guī)律間隔回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及其相關(guān)蛋白（clusteredregularly interspaced short palindromic repeats-associated proteins，Cas）的出現(xiàn)[3]彌補(bǔ)了傳統(tǒng)基因編輯技術(shù)的缺點(diǎn)。Cas蛋白家族中，Cas9蛋白因設(shè)計制造簡單、高速、高效、低成本等優(yōu)勢，被快速和廣泛使用，成為科學(xué)研究和醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具。

豬是重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)動物，CRISPR-Cas9技術(shù)在活體豬中的應(yīng)用不僅有助于提高豬的生產(chǎn)和繁殖性能，還有利于編輯和改良豬品種。

1 CRISPR-Cas9技術(shù)發(fā)展歷程

1987年，科研工作者發(fā)現(xiàn)大腸桿菌基因組IAP基因有特殊的重復(fù)間隔序列存在。2000年，研究人員發(fā)現(xiàn)大多數(shù)古菌、細(xì)菌以及線粒體基因組中均有規(guī)則重復(fù)間隔序列，并命名為規(guī)則短回文間隔重復(fù)序列（short regularly spaced repeats）[4]。2年后，Jansen等[5]發(fā)現(xiàn)，原核生物基因組中有新的重復(fù)序列，根據(jù)該重復(fù)基因座家族的結(jié)構(gòu)特性，將其命名為規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)序列。Barangou等[6]在噬菌體試驗(yàn)中，首次證實(shí)原核細(xì)胞的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，并發(fā)現(xiàn)噬菌體DNA能被crisprRNA特異性斷裂。2012年，美國伯克利實(shí)驗(yàn)室研究員Jenik等[7]把crRNA-tracrRNA復(fù)合物簡潔化，改造成嵌合體單鏈結(jié)構(gòu)，即向?qū)NA（guide RNA，gRNA）。

2014年，Wu等[8]把CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用在哺乳動物細(xì)胞上進(jìn)行基因組結(jié)合，并純化CRISPR及CRISPR相關(guān)蛋白技術(shù)。2017年，Abudayyeh等[9]研究表明，Cas酶可特異性降低哺乳動物細(xì)胞中RNA水平。哈佛大學(xué)Vikram等[10]在動物細(xì)胞基因組編輯程序中對天然蛋白質(zhì)Cas9進(jìn)行修飾，獲得一種新的Cas酶Cas9。該酶是具有更高DNA特異性Cas9突變體。隨著基因編輯技術(shù)不斷完善，高效且高特異性Cas9蛋白變體的數(shù)量庫不斷增長，促使基因組編輯技術(shù)發(fā)展更加迅速。

2 CRISPR-Cas9技術(shù)原理及功能

2.1 CRISPR-Cas9技術(shù)原理（見圖1）

由圖1可知，CRISPR-Cas9編輯技術(shù)由內(nèi)切酶靶向位點(diǎn)切割生物基因組使DNA雙鏈斷裂（double strand break，DSB）。DSB在細(xì)胞內(nèi)的修復(fù)方式為同源重組（homologous recombination）和非同源末端連接（nonhomologous end joining）。其中，非同源末端連接的修復(fù)機(jī)制主要發(fā)生于真核生物[11]，通過核苷酸的插入或缺失，不需要同源序列即可重新連接DNA游離末端，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)基因敲除的目的[12]。當(dāng)同源序列存在時，DSB區(qū)間大概率發(fā)生同源重組，進(jìn)而定點(diǎn)敲入或編輯基因[13]。

2.2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)功能

CRISPR-Cas系統(tǒng)存在于絕大多數(shù)古生菌和近半細(xì)菌中，對外源性病毒和質(zhì)粒入侵有著天然的免疫防御機(jī)制[14]。目前，CRISPR-Cas系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛的是來自產(chǎn)膿鏈球菌的Ⅱ型系統(tǒng)，即CRISPR-Cas9系統(tǒng)。該系統(tǒng)的構(gòu)成為重復(fù)序列和間隔序列；重復(fù)序列高度保守，上游有前導(dǎo)序列（leader sequence），前導(dǎo)序列引導(dǎo)集群間隔短回文序列轉(zhuǎn)錄成非編碼CRISPR RNA（crRNA），crRNA與反式激活RNA（trans-activating crRNA,tracrRNA）結(jié)合形成復(fù)合物。CRISPR-Cas9系統(tǒng)工作原理（見圖2）。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)由CRISPR序列和Cas9基因構(gòu)成，CRISPR序列又包括前導(dǎo)序列、重復(fù)序列和間隔區(qū)。由圖2可知，該系統(tǒng)主要概括為3個過程，分別為適應(yīng)、表達(dá)和干擾[15]。外源物質(zhì)入侵機(jī)體時，外源物質(zhì)顆粒的小段脫氧核糖核苷酸序列會整合到宿主基因組的前導(dǎo)序列和重復(fù)序列之間，跟隨宿主DNA復(fù)制，生成新結(jié)構(gòu)[6]。在表達(dá)過程中，首先把CRISPR基因組轉(zhuǎn)錄成一段長鏈RNA，即CRISPR RNA前體；Cas蛋白則生成復(fù)合物，該復(fù)合物執(zhí)行內(nèi)切酶的功能，將crRNA特異性切割并加工成成熟的crRNA；加工后的crRNA和Cas蛋白結(jié)合形成復(fù)合體，在干擾過程中發(fā)揮其功能[4]。當(dāng)外源物質(zhì)顆粒再次接觸宿主時，crRNA與同源外源核酸序列自然結(jié)合，復(fù)合體將外源核酸切割成碎片，保護(hù)宿主免受侵害[6]。

3 CRISPR-Cas9技術(shù)的應(yīng)用

3.1 CRISPR-Cas9技術(shù)在育肥豬生產(chǎn)中的應(yīng)用

育肥豬自然狀態(tài)下生長緩慢、瘦肉率低，難以達(dá)到要求，可采用基因編輯技術(shù)修飾生長相關(guān)基因來改變當(dāng)前狀態(tài)。

肌肉生長抑制素（myostatin，MSTN）是一種抑制肌細(xì)胞生長的蛋白，由動物肌細(xì)胞天然產(chǎn)生。MSTN不僅能夠抑制骨骼肌細(xì)胞的增殖和分化，還能夠決定肌肉纖維的數(shù)量，是影響肌肉生長和瘦肉率的主要代謝抑制因子。車東升等[16]利用CRISPR-Cas9技術(shù)在豬胚胎成纖維細(xì)胞（porcine embryonic fibroblasts，PEFs）中誘導(dǎo)非同源末端連接，通過體細(xì)胞核移植技術(shù)和胚胎移植技術(shù)獲得MSTN突變仔豬。結(jié)果表明，雙心MSTN基因豬骨骼肌纖維越多、瘦肉率越高。

可選擇標(biāo)記基因（selectable marker gene，SMG）是動物體內(nèi)源基因，該基因可能干擾引入基因的正常表達(dá)，并使宿主對抗生素產(chǎn)生耐藥性，對整體性能產(chǎn)生不利影響。2016年，Bi等[17]利用CRISPR-Cas9和Cre-LoxP重組方法，敲除豬原代細(xì)胞中MSTN的特定等位基因KO，并使用Cre重組酶從等位基因KO中刪除SMG，并制備無標(biāo)簽MSTN基因克隆豬。western-blot檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，基因克隆豬MSTN蛋白表達(dá)量大幅下降，肌肉中相關(guān)基因表達(dá)效果顯著增強(qiáng)。

2017年，Zheng等[18]采用CRISPR-Cas9介導(dǎo)非同源重組整合外源片段，利用SCNT和ET技術(shù)構(gòu)建KI基因特異性編碼解偶蛋白1（uncoupling protein 1，UCP1）修飾豬，使UCP1小鼠基因在白豬脂肪組織中特異性表達(dá)。研究結(jié)果表明，UCP1基因能降低脂肪合成、提高瘦肉率。KI-UCP1突變豬具有胴體率高、脂肪沉積少的優(yōu)點(diǎn)，生產(chǎn)含KIUCP1基因的突變豬能夠改善熱調(diào)節(jié)、增強(qiáng)仔豬在寒冷環(huán)境中產(chǎn)熱能力，提高仔豬存活率，降低低溫對生豬生產(chǎn)造成的經(jīng)濟(jì)損失，為人類提供健康優(yōu)質(zhì)的豬肉及其副產(chǎn)品。

3.2 CRISPR-Cas9技術(shù)在抗豬繁殖與呼吸綜合征中的應(yīng)用

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and repiratory syndrome virus，PRRSV）引起的只感染豬并引起母豬妊娠流產(chǎn)，仔豬和育肥豬肺炎的急性傳染病。2007年，Jay等[19]研究表明，CD163基因是PRRSV的細(xì)胞融合受體。PRRSV入侵細(xì)胞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域?yàn)镾RCR5，由PRRSV的第7個外顯子編碼組成。為進(jìn)一步研究CD163基因結(jié)構(gòu)功能，韓曉松等[20]針對豬CD163基因第6和第7個內(nèi)含子分別設(shè)計成對sgRNA，構(gòu)建sgRNA成對表達(dá)載體；敲除CD163基因關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域SRCR5序列，構(gòu)建SRCR5刪除的大白豬胎兒成纖維細(xì)胞；利用體細(xì)胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技術(shù)成功制備了CD163 SRCR5缺失突變豬，為后續(xù)研究豬抵抗PRRSV奠定基礎(chǔ)。2017年，Christine等[21]研究發(fā)現(xiàn)，CD163 SRCR5缺失依然能在巨噬細(xì)胞表面正確表達(dá)，表明SRCR5能清除血紅蛋白-結(jié)合珠蛋白的特性。為驗(yàn)證SRCR5缺失豬巨噬細(xì)胞對PRRSV的感染情況，該團(tuán)隊制備敲除CD163 SRCR5基因修飾豬，刪除CD163第7個外顯子，得到特定編輯質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，顯微注射至豬受精卵胞質(zhì)，獲得外顯子7缺失仔豬。結(jié)果顯示，CD163 SRCR5刪除編輯豬能完全抵抗PRRSV，并保留該基因的生物學(xué)功能。2019年，Guo等[22]制備出敲除SRCR5中LBP（Ligand-binding pocket，LBP）的基因修飾豬。

3.3 CRISPR-Cas9在抗豬傳染性胃腸炎上的應(yīng)用

豬傳染性胃腸炎（transmissible gastroenteritis of swine，TGE）是由豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus，TGEV）引起仔豬嘔吐、脫水為特征的高度傳染性疾病。2019年，Luo等[23]采用CRISPR-Cas9技術(shù)破壞豬傳染性胃腸炎病毒中的一個假定受體氨基肽酶-N（APN），成功獲得了APN基因失活豬。后續(xù)試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，APN失活豬能正常存活和繁殖，新生仔豬對高致病性傳染性胃腸炎病毒有抗藥性；經(jīng)過組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，腸道中的胃腸炎病毒未引起APN失活豬腸道病變，但野生型仔豬小腸出現(xiàn)典型病變；免疫化學(xué)分析表明APN失活豬腸道組織中未發(fā)現(xiàn)傳染性胃腸炎病毒抗原。經(jīng)過病毒感染試驗(yàn)測試證明，APN失活豬能有效抵抗TGEV。

3.4 CRISPR-Cas9在抗非洲豬瘟中的應(yīng)用

非洲豬瘟（African swine fever，ASF），一種由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的烈性傳染病。自該病暴發(fā)以來，國內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。2018年，科研人員通過轉(zhuǎn)染編碼Cas9質(zhì)粒和sgRNA引導(dǎo)非洲豬瘟病毒CP204L基因密碼子71向78改性，并以此得到野豬肺（WSL）細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)靶向Cas9能使病毒基因組裂解，并降低病毒量[24]。同年，Borca等[25]以豬巨噬細(xì)胞作為細(xì)胞基質(zhì)，從高致病性毒株Georgia07基因中敲除非必需基因8-DR，獲得重組病毒，為將來疫苗研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

3.5 CRISPR-Cas9技術(shù)在器官移植上的應(yīng)用

異種移植間的超免疫排斥主要難題是α-GAL和non-GAL抗原，它們負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)機(jī)體體液超敏反應(yīng)。2014年，Li等[26]通過敲除豬體內(nèi)與免疫排斥反應(yīng)相關(guān)、在人體中已自然消失的基因，減輕異種器官移植帶來的排斥反應(yīng)。同年，Masahiro等[27]破壞豬A-1，3-半乳糖轉(zhuǎn)移酶基因（GGTA1），使α-GAL表位合成受阻，降低了超急性排斥反應(yīng)的發(fā)生概率。Chuang等[28]在敲除GGTA1基因的小型豬進(jìn)行相關(guān)基因編輯得到3種突變豬biallelic mutant pig（bMt）、monoallelic mutant pig（mMt）、non-mutant pig（nMt）。該團(tuán)隊研究人員對3種突變豬外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）細(xì)胞毒性測定，發(fā)現(xiàn)bMt pig的PBMC存活率最高，達(dá)到80%，PBMC存活率越高，超免疫排斥反應(yīng)越小。2017年，高景波[29]對GGTAL1敲除的巴馬小型豬再破壞豬β1，4N-乙酰半乳糖胺轉(zhuǎn)移酶基因（β1，4N-acetylgalactosaminyl transferase，β1，4NGalNT2）,該基因編碼的蛋白能夠引起異種移植排斥反應(yīng)，減少因異種移植排斥反應(yīng)帶來的影響。

異種移植除受免疫排斥反應(yīng)的干擾，豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（porcine endogenous retroviruses，PERV）的難題亟須解決。2015年，Yang等[30]使用CRISPR-Cas9技術(shù)整合Cas9編輯酶到豬基因組中誘導(dǎo)豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒逆轉(zhuǎn)錄酶基因突變，抑制PERV復(fù)制。2017年，Niu等[31]敲除豬體內(nèi)所有PERV基因，使得豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒傳播的風(fēng)險降低。同年，Yang等[30]與云南農(nóng)業(yè)大學(xué)魏紅江教授合作研究顯示，豬細(xì)胞中的PERV能夠感染人細(xì)胞并傳染體外的人體細(xì)胞。為清除異種器官移植過程中內(nèi)源性病毒跨種傳染的風(fēng)險，研究人員采用CRISPR-Cas9技術(shù)結(jié)合細(xì)胞凋亡相關(guān)抑制劑、生長因子制備出PERV滅活的原發(fā)性豬細(xì)胞系、胚胎以及活豬。PERV滅活豬能夠提供更安全、有效的器官，以解決器官供應(yīng)短缺的問題[30]。有研究人員采用crispr-cas9技術(shù)刪除豬胚胎中關(guān)鍵器官形成基因，創(chuàng)造遺傳“空位”，并將人誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（human induced pluripotent stem cell，HIPSC）注射至豬胚胎中，成功培養(yǎng)出含人體細(xì)胞的豬胚胎。張玄等[32]研究敲除PERV，同時敲除3種主要異種抗原并敲入9種人源化基因，獲得腎臟、肝臟、心臟，建立豬-猴異種器官臨床研究模型，結(jié)果表明，豬在克服超急性排斥反應(yīng)、緩解體液排斥反應(yīng)以及凝血紊亂上比較有優(yōu)勢，但能否作為臨床異種器官移植供需體仍有待進(jìn)一步研究。

4 展望

CRISPR和CRISPR相關(guān)蛋白技術(shù)，自2013年首次被應(yīng)用于乳腺細(xì)胞，在短時間內(nèi)得到較快發(fā)展，推動生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域大量研究，已成為當(dāng)今世界上應(yīng)用最廣泛的基因編輯技術(shù)。與傳統(tǒng)的選擇性技術(shù)相比，CRISPR-Cas9技術(shù)優(yōu)勢明顯，可對特定基因進(jìn)行編輯操作，短時間內(nèi)即可獲得目的基因。CRISPR-Cas9技術(shù)可提高豬的生產(chǎn)性能，縮短繁殖周期，帶來良好的經(jīng)濟(jì)效益。由于控制活豬的基因多且復(fù)雜，想通過改變特定的基因序列使它們的表型顯著體現(xiàn)仍有困難。近年來，養(yǎng)豬業(yè)遭受各種豬病的沖擊，CRISPR-Cas9技術(shù)能夠更好地了解分析病毒，對各類疾病的防控具有重要作用。CRISPR-Cas9技術(shù)促進(jìn)了對動物的生命活動規(guī)律、重大疾病的發(fā)生和發(fā)展的了解，為器官移植提供理論參考和技術(shù)保障。隨著CIRSPR-Cas9技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，該技術(shù)在豬基因組編輯中的應(yīng)用對生物科學(xué)界具有更多的價值與意義。