乳腺癌組織中PD-L1、IMP3表達(dá)水平與患者臨床病理學(xué)特征、術(shù)后復(fù)發(fā)的關(guān)系

蔣莉萍，王 霞，彭心華，宋適寅，瞿 明

（1.吉安市婦幼保健院病理科；2.井岡山大學(xué)醫(yī)學(xué)部；3.吉安市婦幼保健院檢驗科；4.吉安市中心人民醫(yī)院病理科；5.吉安市婦幼保健院乳腺外科，江西 吉安 343000）

近年來，乳腺癌已經(jīng)成為我國女性發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤性疾病，乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致乳腺癌患者死亡的主要原因之一，一旦發(fā)生轉(zhuǎn)移，患者預(yù)后較差，5年生存率僅為20%[1]。惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移是一個多分子共同參與相互作用的復(fù)雜過程，因此對反映乳腺癌細(xì)胞具有侵襲、轉(zhuǎn)移潛能的分子生物指標(biāo)進(jìn)行檢測，有助于乳腺腫瘤的早期篩查、診斷及治療，動態(tài)監(jiān)測乳腺癌轉(zhuǎn)移情況，并評估乳腺癌患者的預(yù)后。胰島素樣生長因子Ⅱ mRNA結(jié)合蛋白3 （IMP3）是一個新發(fā)現(xiàn)的癌胚mRNA結(jié)合蛋白，可與胰島素樣生長因子Ⅱ （IGF-Ⅱ）轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行結(jié)合。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-Ⅱ在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，但關(guān)于IGF-Ⅱ的翻譯調(diào)控因子IMP3在乳腺癌中的表達(dá)研究甚少[2]；程序性死亡受體配體-1 （PD-L1）是腫瘤免疫逃逸過程中的重要免疫檢查點分子，且在多種實體腫瘤組織中呈過表達(dá)，且有研究證實，其過表達(dá)與三陰性乳腺癌患者術(shù)后生存率密切相關(guān)[3]。但目前IMP3和PD-L1在乳腺癌發(fā)生侵襲和進(jìn)展中的臨床意義尚不明確，因此本研究旨在探究兩者在乳腺癌組織中的陽性表達(dá)情況，分析其與患者臨床病理特征、術(shù)后復(fù)發(fā)的相關(guān)性，為臨床乳腺癌患者的治療與預(yù)后評估提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果詳細(xì)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2015年1月至2021年3月吉安市婦幼保健院和吉安市中心人民醫(yī)院收治的102例乳腺浸潤性癌患者的臨床資料，所有患者均保存有完整的病理切片、石蠟檔案及臨床資料。年齡32～89歲，平均（47.60±10.09）歲。參照《WHO（2012）乳腺腫瘤組織學(xué)分類》[4]中相關(guān)乳腺上皮源性腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分類：非特殊類型87例，混合型癌（浸潤性導(dǎo)管癌+特殊類型癌）15 例；TNM 分期：TNM Ⅰ～Ⅱ期 76 例，Ⅲ～Ⅳ期 26例；病理組織學(xué)分級：Ⅰ級56例、Ⅱ級28例、Ⅲ級18例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：轉(zhuǎn)移50例，未轉(zhuǎn)移52例。診斷標(biāo)準(zhǔn)：所有患者均符合《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2017年版）》[5]中關(guān)于乳腺浸潤性癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)者；女性；術(shù)前未行新輔助化療，無任何抗腫瘤治療史者；所有患者均經(jīng)病理學(xué)檢測，并均由高年資的病理醫(yī)師復(fù)核切片確診；所有患者病理組織標(biāo)本均經(jīng)免疫組織化學(xué)染色并由高年資的病理醫(yī)師進(jìn)行判讀評分。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤者；合并全身感染性疾病者；合并心血管疾病或嚴(yán)重肝、腎疾病或其他重大疾病者等。本研究經(jīng)吉安市婦幼保健院和吉安市中心人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 檢驗方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)染色 采用SP法免疫組織化學(xué)染色檢測乳腺癌組織中PD-L1、IMP3表達(dá)情況：乳腺癌病理組織標(biāo)本經(jīng)4%中性甲醛固定，常規(guī)制作石蠟組織切片，進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，所涉一抗：兔抗人IMP3單克隆抗體（克隆號：ZA-0639UM），購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人PD-L1單克隆抗體（克隆號：ZR3），購自基因科技(上海)股份有限公司。將已知的陽性組織做陽性對照和PBS代替一抗做陰性對照。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定方法 采用半定量評分法，根據(jù)每張切片陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)與染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合計分。①PD-L1陽性表達(dá)位于腫瘤細(xì)胞胞膜和淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜（PD-L1只計數(shù)腫瘤內(nèi)和近瘤周的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞）。染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)：無著色計0分，淡黃色顆粒不明顯計1分，棕黃色顆粒計2分，棕褐色顆粒計3分；陽性細(xì)胞占比評分標(biāo)準(zhǔn)：無陽性細(xì)胞計0分，0＜陽性細(xì)胞占比≤?1%計1分，1%＜陽性細(xì)胞占比≤?10%計2分，10%＜陽性細(xì)胞占比≤?50%計3分，陽性細(xì)胞占比＞?50%計4分。②IMP3陽性表達(dá)位于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，其染色強(qiáng)度評分標(biāo)準(zhǔn)同PD-L1，而陽性細(xì)胞占比評分標(biāo)準(zhǔn)為：無陽性細(xì)胞計0分，0＜陽性細(xì)胞占比≤?10%計1分，10%＜陽性細(xì)胞占比≤?50%計2分，50%＜陽性細(xì)胞占比≤?80%計3分，陽性細(xì)胞占比＞80%計4分。免疫組化染色評分=染色強(qiáng)度評分×陽性細(xì)胞百分比評分，分值范圍0～12分，得分≥4分判為陽性，得分＜4分判為陰性。參考半定量標(biāo)準(zhǔn)，隨機(jī)觀察5個高倍視野，計算陽性細(xì)胞百分比及染色強(qiáng)度評分，經(jīng)3位病理高級醫(yī)師判定，在判定結(jié)果中若同一病例存在不同評分視野，則取最大值和最小值的平均值，結(jié)果均經(jīng)2次重復(fù)觀察，計分不一致者再次觀察確認(rèn)。

1.3 觀察指標(biāo) ①統(tǒng)計乳腺癌病理組織中PD-L1、IMP3陽性表達(dá)情況。②分析乳腺癌病理組織中PD-L1、IMP3陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系。③統(tǒng)計并分析乳腺癌病理組織中PD-L1、IMP3陽性表達(dá)與患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險級別的關(guān)系。其中術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險級別評估參照《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2017年版）》[5]，分為低度風(fēng)險（2例），中度風(fēng)險（64例），重度風(fēng)險（36例）。④采用Spearman等級相關(guān)分析探究乳腺癌病理組織中PD-L1、IMP3陽性表達(dá)的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料以[例(%)]表示，兩組間比較采用χ2檢驗，多組間比較采用χ2趨勢檢驗；采用Spearman等級相關(guān)分析乳腺癌組織中IMP3、PD-L1陽性表達(dá)的相關(guān)性。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織PD-L1、IMP3陽性表達(dá)情況 102例乳腺癌病理組織標(biāo)本中PD-L1、IMP3的陽性表達(dá)率分別為57.84%（59/102）、19.61%（20/102）；免疫組織化學(xué)染色顯示，PD-L1在乳腺癌組織中陽性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞膜和淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的胞質(zhì)和胞膜，可見明顯的棕黃色顆粒，見圖1-A； IMP3乳腺癌組織中陽性表達(dá)于腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，可見明顯的黃褐色顆粒，見圖1-B。

2.2 乳腺癌組織PD-L1、IMP3陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 不同年齡、組織學(xué)級別、腫瘤直徑、TNM分期、Ki-67增殖指數(shù)及淋巴轉(zhuǎn)移情況、合并瘤栓情況乳腺癌患者病理組織中IMP3、PD-L1陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；IMP3在不同分子分型乳腺癌患者病理組織中的陽性表達(dá)率從高到低依次為Basal-like型（66.67%）、LuminalB型[人表皮生長因子受體-2(HER-2)陽性]（17.24%）、HER-2過表達(dá)型（15.38%）、LuminalA型（14.29%）、LuminalB型（HER-2陰性）（10.00%），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）；且合并壞死的乳腺癌組織中IMP3陽性表達(dá)率（33.33%）顯著高于未合并壞死者（14.67%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 乳腺癌組織PD-L1、IMP3表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PD-L1、IMP3與乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險級別的關(guān)系 隨著乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險級別的逐漸升高，乳腺癌組織中PD-L1、IMP3陽性表達(dá)率逐漸升高，但組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

表2 PD-L1、IMP3與乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險級別的關(guān)系

2.4 乳腺癌組織中PD-L1、IMP3表達(dá)的相關(guān)性 經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析顯示，乳腺癌組織中PD-L1與IMP3陽性表達(dá)呈正相關(guān)性（r=0.172），但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表 3。

表3 乳腺癌組織中PD-L1、IMP3表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是多基因變化、多階段累積和疊加作用的結(jié)果，乳腺癌晚期易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，是導(dǎo)致患者死亡、預(yù)后不良的關(guān)鍵因素；且多種基因的異常表達(dá)和機(jī)體微環(huán)境中眾多細(xì)胞因子之間的相互作用與乳腺癌的轉(zhuǎn)移、疾病進(jìn)展密切相關(guān)。

腫瘤微環(huán)境中腫瘤細(xì)胞和腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞均可表達(dá)PD-L1，與淋巴細(xì)胞PD-1結(jié)合后可抑制淋巴細(xì)胞免疫和分泌功能，進(jìn)而參與腫瘤進(jìn)展[6]。萬玉秋等[7]報道，PD-L1在浸潤性乳腺癌腫瘤細(xì)胞中陽性表達(dá)率為11.0%～56.6%；李麗煌[8]報道，PD-L1在116例乳腺癌組織中的陽性表達(dá)率為77.59%，且其陽性表達(dá)與乳腺癌的臨床分期、組織學(xué)分級有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，102例乳腺癌病理組織標(biāo)本中PD-L1的陽性表達(dá)率為57.84%（59/102），但PD-L1陽性表達(dá)與乳腺癌患者年齡、組織學(xué)級別、腫瘤直徑、TNM分期、Ki-67增殖指數(shù)、淋巴轉(zhuǎn)移情況、合并瘤栓情況、合并壞死情況及分子分型均無顯著相關(guān)性，分析原因可能與本研究樣本量少有關(guān)，因此臨床仍需進(jìn)一步開展大樣本量深入研究。三陰性乳腺癌是指雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）、HER-2均呈陰性表達(dá)，是較其他亞型腫瘤更具侵襲性的乳腺癌病理分型，其遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移率較高。黃述斌等[9]報道，PD-L1在乳腺癌組織中的總體陽性表達(dá)率為35.3%，尤其在三陰性乳腺癌中陽性率最高；此外，有研究報道，PD-L1陽性腫瘤干細(xì)胞可能參與了三陰性乳腺癌相關(guān)免疫逃逸復(fù)雜動力學(xué)，PD-L1通過與淋巴細(xì)胞表面的PD-1相互作用來削弱機(jī)體對腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸，從而導(dǎo)致三陰性乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展[10]。黃德妤等[11]研究報道，PD-L1 在三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯升高，且其陽性表達(dá)與三陰性乳腺癌 TNM分期、淋巴結(jié)數(shù)量相關(guān)，同時會影響三陰性乳腺癌患者的預(yù)后，PD-L1陽性表達(dá)的三陰性乳腺癌患者術(shù)后生存率明顯降低。本研究中，PD-L1在三陰性乳腺癌（Basal-like型）和非三陰性乳腺癌中（Luminal A型、Luminal B型、HER-2過表達(dá)型）的陽性表達(dá)率分別為77.78%（7/9）和55.91%（52/93），雖無顯著性差異，但三陰性乳腺癌病理組織PD-L1陽性表達(dá)率更高，與上述研究報道相似。

IMP3是一種癌胚蛋白，其可通過上調(diào)IGF-Ⅱ蛋白表達(dá)水平而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增生，且其與乳腺癌干細(xì)胞的功能有關(guān)，目前已有研究報道，其在多種惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的侵襲性關(guān)系密切，因而與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，直接影響腫瘤患者的預(yù)后[12-13]。湯紅平等[14]研究表明，IMP3在乳腺癌中的陽性表達(dá)率為22.86%（81/105），IMP3表達(dá)與組織學(xué)分級、Ki-67高表達(dá)及三陰性乳腺癌有關(guān)。本研究中，102例乳腺癌病理組織中IMP3的陽性表達(dá)率為19.61%；且IMP3在三陰型乳腺癌中陽性表達(dá)率66.67%（6/9），較非三陰型乳腺癌15.05%（14/93）顯著升高；此外，IMP3的陽性表達(dá)率有壞死者（33.33%）較無壞死者（14.67%）顯著升高，提示乳腺癌患者病理組織IMP3陽性表達(dá)與乳腺癌分子分型及壞死與否具有顯著相關(guān)性。但I(xiàn)MP3的表達(dá)與乳腺癌患者年齡、組織學(xué)級別、腫瘤直徑、TNM分期、Ki-67增殖指數(shù)、淋巴轉(zhuǎn)移情況、合并瘤栓情況均無顯著相關(guān)性，分析原因可能還是與入組病例偏少有關(guān)，因此建議后期開展大樣本量深入研究。

IMP3主要與IGF-Ⅱ leader3 mRNA結(jié)合，促進(jìn)其翻譯，繼而促進(jìn)IGF-Ⅱ蛋白表達(dá)，然后通過IGF-Ⅱ蛋白發(fā)揮致癌效果，因此IMP3表達(dá)水平越高，越利于腫瘤疾病的轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)[15]；免疫失調(diào)在腫瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展中普遍存在，而PD-L1是一個重要的免疫卡控點，其可與T淋巴細(xì)胞表面的受體結(jié)合，誘導(dǎo)腫瘤患者發(fā)生免疫抑制應(yīng)答翻譯，介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞逃逸，因而導(dǎo)致腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移，因而腫瘤復(fù)發(fā)風(fēng)險級別較高[16]。本研究結(jié)果顯示，隨著乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險級別的逐漸升高，乳腺癌組織中PD-L1、IMP3陽性表達(dá)率逐漸升高，但組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。同時，本研究中，經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析顯示，乳腺癌組織中PD-L1與IMP3陽性表達(dá)呈正相關(guān)性，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明乳腺癌組織中PD-L1與IMP3陽性表達(dá)無明顯相關(guān)性，但目前有關(guān)乳腺癌病理組織IMP3表達(dá)情況與意義的相關(guān)報道尚不多見，且本研究所入選樣本量偏小，因此研究結(jié)果尚不具備代表性，建議后期臨床繼續(xù)開展大樣本量相關(guān)研究。

綜上，乳腺癌病理組織PD-L1、IMP3高表達(dá)，尤其在三陰性乳腺癌（Basal-like型）病理組織中表達(dá)水平最高，且IPM3陽性表達(dá)及其表達(dá)水平變化與乳腺腫瘤患者的不良預(yù)后和進(jìn)展有關(guān)，而PD-L1的陽性表達(dá)及其表達(dá)變化與腫瘤的不良預(yù)后和進(jìn)展無關(guān)，且兩者間陽性表達(dá)亦無明顯相關(guān)性。但由于本研究樣本量較小，且目前相關(guān)研究報道尚不多見，因此建議臨床后期開展大樣本量深入研究，為臨床乳腺癌患者的分子治療提供依據(jù)。