P-糖蛋白的核酸適配體篩選及應(yīng)用研究

李玉娟， 梁敏， 武廣霞， 孫欣欣， 劉珊， 鄧玉林

(北京理工大學(xué) 生命學(xué)院，北京 100081)

P-糖蛋白是最早由LING等[1]在中國(guó)倉(cāng)鼠的卵巢細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種跨膜蛋白，分子量為170 kd，由人類(lèi)基因mdr1編碼[2]，可通過(guò)消耗ATP的能量將胞內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至胞外[3]，也是迄今研究最多的三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白之一[4]. P-gp在人體中廣泛分布在肝臟、腎臟[5]、胎盤(pán)、小腸及血腦屏障[6-7]等器官及組織中，可以防止有害物質(zhì)進(jìn)入，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，因而也會(huì)影響治療藥物穿越屏障到達(dá)靶點(diǎn)發(fā)揮療效，如治療一些神經(jīng)系統(tǒng)疾病如癲癇、抑郁癥、阿爾茲海默癥等的藥物[8]. 此外，P-gp在許多腫瘤組織中高表達(dá)，能將抗腫瘤藥物如長(zhǎng)春新堿、紫杉醇、阿霉素等排到腫瘤細(xì)胞外[9]，嚴(yán)重影響抗腫瘤藥物的治療效果，由P-gp介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞多藥耐藥的機(jī)制，是抗腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn). 研究學(xué)者多年來(lái)一直致力于開(kāi)發(fā)新型P-gp抑制劑，但大多數(shù)P-gp抑制劑因其毒副作用高、特異性低等缺點(diǎn)，限制了其在臨床的應(yīng)用[10]. 因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新型安全、高效的P-gp抑制劑.

核酸適配體(Apt)是利用指數(shù)富集配體的系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)，從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中體外篩選的，能與特定靶標(biāo)結(jié)合的ssDNA或RNA，其靶標(biāo)可以是小分子、蛋白或細(xì)胞[11-12]，Apt以高親和力、強(qiáng)特異性與靶標(biāo)結(jié)合. Apt因?yàn)橐子诤铣膳c修飾，生產(chǎn)成本低，已作為工具分子在生物分析檢測(cè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[13-15]. 此外，Apt也可作為治療藥物，如Macugen用于老年黃斑病變，還有很多抗腫瘤用的Apt已進(jìn)入Ⅱ、Ⅲ期臨床研究[16]. 目前尚未見(jiàn)P-gp的核酸適配體報(bào)道，Apt能否抑制P-gp外排功能也未有相關(guān)研究.

本文構(gòu)建ssDNA文庫(kù)，基于SELEX技術(shù)篩選P-gp的Apt，采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)和表面等離子體共振法(SPR)兩種方法表征Apt與P-gp的結(jié)合力大小，在人腦微管內(nèi)皮細(xì)胞(hCMEC/D3)、人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)兩種細(xì)胞系上考察Apt對(duì)P-gp外排功能的抑制效果，以期為P-gp相關(guān)研究提供潛在新型抑制劑.

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

甲苯磺酰基磁珠(TMB)、鏈霉親和素磁珠(SMB)(挪威Dynal公司)；寡核苷酸文庫(kù)、上下游引物及生物素修飾的上下游引物、核酸適配體、PCR純化試劑盒(上海生工生物工程公司)；P-gp(美國(guó)Cloud-Clone公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的鏈霉親和素蛋白(HRP-Strepavidin)(上海碧云天生物技術(shù)公司)；氨基聯(lián)試劑盒、再生試劑(甘氨酸-鹽酸，pH 2.5)(美國(guó)GE Healthcare公司)；RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；MEM培養(yǎng)基(美國(guó)GEHyclone公司)；四季青胎牛血清(浙江天杭生物科技公司)；牛血清白蛋白(BSA)、吐溫-20、TE緩沖液、青鏈霉素混合液、DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞、Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基、TMB顯色液、Triton X-100、羅丹明123(北京索萊寶科技公司)；Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·H2O，KH2PO4·H2O(分析純，西隴科學(xué)有限公司)；NaCl，KCl(分析純，北京化學(xué)試劑公司)；SORFA胎牛血清(浙江碩華生命科學(xué)研究公司)；環(huán)孢菌素A(上海梯希愛(ài)化成工業(yè)發(fā)展公司)；pEASY-T1克隆載體(北京全式金生物技術(shù)公司).

1.2 儀器與耗材

磁力收集器(MPC，挪威Dynal公司)；GE Biacore T200生物分子相互作用分析系統(tǒng)、Series S CM5芯片(美國(guó)GE Healthcare公司)；多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)ChampGel 3200(美國(guó)Bio Rad公司)；R232 PCR儀(美國(guó)MJ Research公司)；倒置顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；培養(yǎng)皿、離心管、96孔板(美國(guó)Corning公司).

1.3 細(xì)胞株

人腦微管內(nèi)皮細(xì)胞(hCMEC/D3)購(gòu)自上海賽百慷生物技術(shù)股份有限公司；人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)由首都醫(yī)科大學(xué)饋贈(zèng).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 SELEX技術(shù)篩選Apt

2.1.1ssDNA初始文庫(kù)的構(gòu)建

設(shè)計(jì)兩端18 bp固定序列，中間45 bp隨機(jī)序列的81 bp寡核苷酸ssDNA文庫(kù)，并用Primier Premier 5.0軟件(加拿大Premier公司)設(shè)計(jì)上、下游引物及生物素修飾的上、下游引物. 引物序列如表1所示.

表1 81 bp寡核苷酸隨機(jī)文庫(kù)及引物Tab.1 81 bp oligonucleotide library and primers

2.1.2ssDNA初級(jí)文庫(kù)的篩選

取10 μL TMB磁珠，與50 μL 0.1mg/mL的P-gp溶液(ddH2O配制)、100 μL緩沖液1、100 μL緩沖液2混合，4 ℃孵育過(guò)夜，后各用1 mL緩沖液3清洗1次，1 mL緩沖液4清洗2次，每次均在MPC上靜置2 min，棄去上清，最后用12.5 μL的緩沖4重懸，得到TMB-P-gp復(fù)合物(篩選緩沖液的配方如表2所示). 將前述TMB-P-gp復(fù)合物與1 OD的ssDNA(100 μmol/L)混合，加入200 μL PBS，4 ℃孵育2 h，后用200 μL PBS清洗3次，得到TMB-P-gp-ssDNA復(fù)合物. 取40 μL的TE緩沖液加入到TMB-P-gp-ssDNA復(fù)合物中，95 ℃水浴15 min，將結(jié)合在TMB-P-gp復(fù)合物上的ssDNA洗脫，同時(shí)使用MPC清除TMB-P-gp復(fù)合物，可得到ssDNA溶液. 使用未生物素修飾的上游引物與生物素修飾的下游引物對(duì)得到的ssDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，條件為：引物用量2.5 μL；94 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s；56.3 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；循環(huán)數(shù)為15. 擴(kuò)增結(jié)束后，使用4%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物.

表2 ssDNA篩選中使用的緩沖液及其組成Tab.2 The buffer and formula used to select ssDNA

2.1.3ssDNA次級(jí)文庫(kù)的制備

將2.1.2中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，使用酶標(biāo)儀測(cè)定dsDNA的濃度. 根據(jù)磁珠推薦固載量(100 ng dsDNA每5 μL SMB)向dsDNA中加入適量的SMB，在37 ℃搖床孵育0.5 h，得到SMB-dsDNA復(fù)合物. 取200 μL 100 mmol/L的NaOH溶液加入到SMB-dsDNA復(fù)合物中，室溫下堿變性15 min使未生物素化的ssDNA從SMB磁珠中洗脫下來(lái). 取40 μL 1 mol/L的NaH2PO4(pH=3.2)中和ssDNA洗脫液，便可得到ssDNA次級(jí)文庫(kù).

2.1.4ssDNA次級(jí)文庫(kù)的篩選

將2.1.3中的ssDNA次級(jí)文庫(kù)，作為新的起始文庫(kù)，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟，本研究共進(jìn)行了10輪重復(fù)篩選實(shí)驗(yàn). 當(dāng)篩選進(jìn)行到第4輪時(shí)，進(jìn)行一次反篩選，即用未固定P-gp的TMB磁珠與篩選的ssDNA文庫(kù)孵育2 h，使用磁力分離器分離磁珠，得到不與TMB磁珠結(jié)合的ssDNA. 且每一輪篩選結(jié)束后，均使用ELISA法表征篩選的ssDNA與P-gp的結(jié)合能力，且每4輪進(jìn)行一次反篩選實(shí)驗(yàn). 實(shí)驗(yàn)中為得到特異性強(qiáng)的目標(biāo)條帶，每輪篩選的P-gp用量、PCR反應(yīng)條件以及TMB-P-gp復(fù)合物與ssDNA的孵育時(shí)間略有不同. 其中，P-gp溶液用量的體積分別為：1～3輪5 μL，4～7輪4.8 μL，8～10輪4.6 μL. PCR反應(yīng)中引物用量及循環(huán)數(shù)分別為：1～5輪2.5 μL，循環(huán)數(shù)15；第6輪5 μL，循環(huán)數(shù)20；7～8輪2.5 μL，循環(huán)數(shù)15；9～10輪5 μL，循環(huán)數(shù)20. TMB-P-gp復(fù)合物與ssDNA的孵育時(shí)間分別為：1～3輪120 min，4～6輪90 min，7～8輪70 min，9～10輪60 min.

2.1.5克隆與測(cè)序

第10輪篩選結(jié)束后，將得到的ssDNA用未生物素修飾的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增. 取上述擴(kuò)增后產(chǎn)物0.5～4.0 μL與pEASY-T1克隆載體按1 μL載體：1.6 ng PCR產(chǎn)物的比例混合，補(bǔ)充ddH2O至5 μL，室溫下反應(yīng)10 min. 取50 μL的感受態(tài)細(xì)胞DH5α加入到上述混合物中，冰浴30 min，42 ℃熱激30 s，然后置于冰上冷卻2 min. 向混合物中加入250 μL的LB培養(yǎng)基，放置于37 ℃搖床中培養(yǎng)1 h. 將上述菌液4 000 r/min離心1 min后，保留100 μL涂布于平板中，37 ℃培養(yǎng). 第二天選擇生長(zhǎng)狀況良好的單個(gè)菌落，加入5 mL LB培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h. 將上述含菌培養(yǎng)液送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序.

2.2 Apt與P-gp結(jié)合能力的表征

2.2.1ELISA方法表征結(jié)合能力

上述ssDNA測(cè)序后，即可得到目標(biāo)Apt的核酸序列. 由上海生工生物工程股份有限公司按已知核酸序列合成Apt及進(jìn)行生物素修飾. 將上述合成的Apt用雙蒸水配制成0.1，0.4，0.8，1.0，2.0，5.0 μmol/L的系列溶液備用. 用100 μL 5 μg/mL的P-gp溶液包被96孔板(Nunc TM，丹麥)，4 ℃過(guò)夜孵育. 每孔加入300 μL 0.1%的BSA封閉液(PBST配制，即含0.05%吐溫-20的PBS溶液)，在4 ℃封閉1 h. 微孔中加入100 μL相應(yīng)濃度的Apt溶液，37 ℃孵育1 h后，向每孔中加入100 μL的HRP-Strepavidin，室溫孵育1 h. 每步操作后均用300 μL的PBST清洗微孔3次. 最后向微孔中加入100 μL TMB顯色液，避光反應(yīng)直至藍(lán)色褪去時(shí)，加入50 μL H2SO4終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀450 nm下測(cè)OD值. 以Apt濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)進(jìn)行非線性擬合可得到P-gp結(jié)合Apt的量隨Apt濃度變化的關(guān)系，依據(jù)式(1)[17]求算復(fù)合物的解離常數(shù)

Y=BmaxX/(Kd+X)

(1)

式中：Y為OD值；Bmax為P-gp的最大吸附量；Kd為Apt-P-gp復(fù)合物的解離常數(shù).

2.2.2SPR法表征結(jié)合能力

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需按照式(2)計(jì)算配體P-gp的偶聯(lián)量，分析物為Apt，其中Rmax預(yù)設(shè)為100 RU，Sm為1，計(jì)算出RL后，P-gp的實(shí)際偶聯(lián)量為1.5RL. 采用下述步驟將P-gp偶聯(lián)到CM5芯片上，具體為：P-gp溶解在10 mmol/L、pH為4.5的醋酸鈉緩沖液中，終濃度為20 μg/mL，使用氨基偶聯(lián)試劑盒活化CM5芯片表面的羧基后，P-gp以脈沖方式進(jìn)樣，通過(guò)吸附方式偶聯(lián)在芯片的表面上，并用乙醇胺封閉多余的羧基. 接下來(lái)選用pH 2.5、10 mmol/L的甘氨酸緩沖液為再生試劑，對(duì)濃度梯度為0，17，34，51，68，85 μmol/L的10條適配體依次進(jìn)樣，用GE Biacore T200生物分子互作分析系統(tǒng)收集系列濃度Apt的響應(yīng)值，分析Apt與P-gp的結(jié)合力.

(2)

式中：RL為配體偶聯(lián)水平；Sm為化學(xué)計(jì)量比；Ml為配體分子量；Ma為分析物分子量.

2.3 Apt對(duì)P-gp外排功能的抑制作用

2.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

將hCMEC/D3復(fù)蘇在含10%四季青胎牛血清，1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中；將Caco-2復(fù)蘇在含10%SORFA胎牛血清，1%青鏈霉素的MEM培養(yǎng)基中. 上述兩種細(xì)胞均培養(yǎng)在含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，每天置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，待傳代2～3次后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.3.2P-gp底物羅丹明123的外排實(shí)驗(yàn)

將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞以2×105個(gè)/mL接種于96孔板中，每孔100 μL，復(fù)孔3個(gè)，放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h. 將96孔板中的培養(yǎng)基倒出，每孔加入100 μL含羅丹明123與Apt5的培養(yǎng)基，且羅丹明123的終濃度為5 μmol/L，Apt5的終濃度為0.5 μmol/L，同時(shí)使用環(huán)孢菌素A(Cyclo A)做陽(yáng)性對(duì)照，終濃度為50 μmol/L；PBS做空白對(duì)照(Con). 將96孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育2 h后，將孔板中溶液倒出，并用PBS清洗3次，每孔加入100 μL 0.1%的Triton X-100，15 min后于酶標(biāo)儀下檢測(cè)每孔的熒光強(qiáng)度. 羅丹明123的激發(fā)波長(zhǎng)為485 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為535 nm.

2.4 數(shù)據(jù)處理

使用GraphpadPrism v7.0(美國(guó)Graphpad軟件公司)數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用單因素方差分析顯著性，P<0.05時(shí)具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

3 結(jié)果與討論

3.1 P-gp核酸適配體的篩選結(jié)果

本文對(duì)核酸適配體篩選過(guò)程中的一些關(guān)鍵步驟，如寡核苷酸初始文庫(kù)的大小、每輪結(jié)合時(shí)P-gp的用量、P-gp-TMB復(fù)合物與ssDNA文庫(kù)的孵育時(shí)間、及每輪的PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行了優(yōu)化. 首先，構(gòu)建了80 bp和81 bp兩個(gè)不同大小的ssDNA文庫(kù)，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳，比較了80 bp和81 bp文庫(kù)擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)81 bp文庫(kù)得到的非特異性條帶最少，因此將其作為篩選Apt的初始文庫(kù). 其次，在篩選過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)每輪結(jié)合時(shí)P-gp的用量、及P-gp-TMB復(fù)合物與ssDNA文庫(kù)的孵育時(shí)間是影響篩選產(chǎn)物特異性的重要因素，通過(guò)減少每輪的P-gp用量，縮短P-gp-TMB復(fù)合物與ssDNA文庫(kù)的孵育時(shí)間，可以篩選得到與P-gp特異性結(jié)合能力更強(qiáng)的ssDNA. 此外，每輪PCR擴(kuò)增條件也會(huì)顯著影響篩選產(chǎn)物的特異性，其中，本文對(duì)影響PCR擴(kuò)增的3個(gè)重要條件如退火溫度、循環(huán)數(shù)及引物用量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明56.3 ℃的退火溫度適用于各輪篩選. 且在PCR的每輪進(jìn)程中，要依據(jù)瓊脂糖凝膠電泳的特異性條帶結(jié)果，來(lái)適當(dāng)調(diào)整每輪PCR擴(kuò)增的循環(huán)數(shù)及引物用量，確保每一輪都得到特異性的擴(kuò)增產(chǎn)物. 在整個(gè)篩選過(guò)程中，收集每輪篩選得到的ssDNA，取適量用ELISA法表征每輪篩選得到的ssDNA與P-gp的結(jié)合能力，當(dāng)吸光度不再上升時(shí)，指示篩選循環(huán)結(jié)束，同時(shí)，采用其他蛋白如卵清蛋白為對(duì)照，以評(píng)價(jià)ssDNA與P-gp結(jié)合的特異性.

如圖1所示，ssDNA與P-gp的親和性隨篩選進(jìn)程增加，篩選至第10輪時(shí)，吸光度基本不再上升. 卵清蛋白與ssDNA親和性不隨篩選進(jìn)程改變，且卵清蛋白與ssDNA的結(jié)合力遠(yuǎn)小于ssDNA與P-gp的結(jié)合力，這在一定程度上表明了Apt與P-gp的結(jié)合具有特異性. 本研究最終篩選得到10條長(zhǎng)度為81 bp的P-gp特異性核酸適配體(依次標(biāo)記為Apt1～ Apt10)，其序列如表3所示. 使用Clustal X 2.1軟件(European Bioinformatics Institute，)對(duì)Apt的一級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)10條Apt序列中同一堿基連續(xù)出現(xiàn)的頻率較高(不含引物區(qū))，如GGG、TTT、AAA、CCC的堿基組合分別重復(fù)出現(xiàn)6次、5次、6次、5次；TTTT的堿基組合出現(xiàn)2次；GGGGG、CCCCC的堿基組合分別出現(xiàn)3次、2次；復(fù)雜的堿基組合TTTTCC也出現(xiàn)2次. 根據(jù)Apt與P-gp親和力的表征結(jié)果，比對(duì)分析了與P-gp親和力最強(qiáng)的三條核酸適配Apt5、Apt8與Apt1的序列，發(fā)現(xiàn)三者中GGG與AAA的堿基組合出現(xiàn)頻率最高. 3條Apt序列的第2，4，6，8，30，34，39，40位具有相同的堿基. 以上結(jié)果或許說(shuō)明特定的堿基順序及其在序列中出現(xiàn)的頻率決定了Apt與P-gp間的結(jié)合能力. 使用Mfold在線軟件(http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold)分析了Apt的二級(jí)結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)10條Apt的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示均以莖環(huán)和口袋為主. 其中，Apt1，Apt5，Apt8的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是小口袋大莖環(huán)(如圖2所示)，表現(xiàn)為序列從5′到3′端在23～46堿基形成單一口袋，在口袋的5′端、隨機(jī)序列區(qū)或3′端形成2～3個(gè)較大的莖環(huán)，說(shuō)明徑環(huán)與口袋的結(jié)構(gòu)特征或許是Apt能與P-gp特異性結(jié)合的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ).

圖1 ELISA法測(cè)得每輪篩選的ssDNA與P-gp、卵清蛋白的親和性Fig.1 Affinity of selected ssDNA in every round binding with P-gp or ovalbumin by ELISA

表3 P-gp核酸適配體的核酸序列Tab.3 The nucleic acid sequence of P-gp aptamers

圖2 Mfold軟件預(yù)測(cè)Apt1, Apt5, Apt8的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.2 Predicted secondary structure of Apt1, Apt5 and Apt8 with Mfold software

3.2 ELISA法測(cè)定Apt與P-gp的結(jié)合能力

用ELISA法測(cè)定不同濃度的Apt與0.5 μg P-gp結(jié)合時(shí)的吸光度(如圖3所示)，根據(jù)式(1)可求得Apt與P-gp結(jié)合的解離常數(shù)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4. Apt與P-gp結(jié)合的解離常數(shù)大小可以反映二者結(jié)合能力的強(qiáng)弱，且解離常數(shù)越小，結(jié)合能力越強(qiáng). ELISA法測(cè)定的Apt與P-gp結(jié)合的解離常數(shù)在10-8～10-7mol/L范圍，表明Apt與P-gp具有較強(qiáng)的結(jié)合能力[18]. 其中，Apt5，Apt8和Apt1與P-gp結(jié)合的解離常數(shù)最小，依次為17.46，25.15和28.56 nmol/L，表明Apt5，Apt8和Apt1均與P-gp具有較高的結(jié)合能力. 此外，Apt5，Apt8和Apt1的核酸序列中GC含量豐富，分別為66.7%，50.6%和57.8%，說(shuō)明Apt與P-gp結(jié)合能力的強(qiáng)弱可能與GC含量有關(guān). ELISA法測(cè)得的10條Apt與P-gp結(jié)合能力的大小順序?yàn)椋篈pt5>Apt8>Apt1>Apt4>Apt6>Apt10>Apt7>Apt2>Apt9>Apt3.

圖3 ELISA法測(cè)得的Apt1，Apt5及Apt8吸光度與Apt濃度的非線性曲線Fig.3 Nonlinear curve between absorbance and concentration of Apt1, Apt5 and Apt8 by ELISA

表4 ELISA法測(cè)得Apt與P-gp結(jié)合的解離常數(shù)

3.3 SPR法測(cè)定Apt與P-gp的結(jié)合能力

本研究也利用SPR法表征了Apt與P-gp的結(jié)合能力，儀器響應(yīng)值隨Apt濃度變化的曲線如圖4所示. 在該實(shí)驗(yàn)中，為提高CM5芯片偶聯(lián)P-gp的量，對(duì)溶解P-gp的緩沖液的PH值進(jìn)行了優(yōu)化. 通過(guò)比較不同PH值的醋酸鈉緩沖液進(jìn)樣時(shí)芯片與P-gp的偶聯(lián)量，最終選用PH為4.5的醋酸鈉緩沖液，該pH條件下P-gp的荷電量增加(P-gp的等電點(diǎn)為8.95)，富集在芯片上的量也增加，能達(dá)到較理想的偶聯(lián)效果. 用SPR法測(cè)得的Apt與P-gp結(jié)合的解離常數(shù)如表5所示. 結(jié)果表明，Apt5，Apt1和Apt8的解離常數(shù)最小，依次為1.691，3.524和3.487 μmol/L，表明Apt5，Apt1和Apt8具有較強(qiáng)的結(jié)合P-gp的能力，該結(jié)果與用ELISA方法測(cè)得的結(jié)果基本一致.

圖4 Apt與P-gp的結(jié)合響應(yīng)信號(hào)傳感圖Fig.4 Sensor-gram for the binding response signals of Apt with P-gp

表5 SPR法測(cè)得Apt與P-gp結(jié)合的解離常數(shù)

ELISA和SPR法均是文獻(xiàn)中用來(lái)測(cè)定蛋白及其配體間親和力的常用方法，但二者的基本原理不同，產(chǎn)生誤差的主要來(lái)源也不盡相同，因而測(cè)得的數(shù)值會(huì)存在一定的差異. 多個(gè)文獻(xiàn)的研究結(jié)果表明，當(dāng)采用不同方法測(cè)定同一組蛋白及其配體間的親和力時(shí)，檢測(cè)結(jié)果或會(huì)相差1～2個(gè)數(shù)量級(jí). 研究者認(rèn)為產(chǎn)生數(shù)值差異的原因與抗原包被的流程相關(guān)，雖然不同方法檢出能力不同，但是相關(guān)結(jié)果仍具有參考性[19-20]. 也有研究者用SPR法測(cè)靶標(biāo)蛋白及適配體間的解離常數(shù)，結(jié)果也在μmol/L范圍級(jí)別，但并不能說(shuō)明二者間相互作用弱[21]，具體的原因或許與測(cè)定的方法、原理及誤差等有關(guān)系，尚需進(jìn)一步的研究. 此外，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)多次重復(fù)，測(cè)定的結(jié)果也是穩(wěn)定與重現(xiàn)的. 本實(shí)驗(yàn)中雖然SPR及ELISA法測(cè)定的數(shù)量級(jí)范圍不同，但兩種方法表征的Apt與P-gp親和力大小的順序基本一致. 本研究通過(guò)兩種方法，均證明篩選得到的Apt與P-gp具有較強(qiáng)的親和性. 其中，Apt5與P-gp的結(jié)合能力最強(qiáng)，因此選擇Apt5進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

3.4 Apt5對(duì)hCMEC/D3及Caco-2細(xì)胞內(nèi)羅丹明123蓄積量的影響

Apt對(duì)P-gp外排功能的抑制作用通過(guò)P-gp的底物羅丹明123的熒光強(qiáng)度反映，且細(xì)胞內(nèi)羅丹明123越多，熒光越強(qiáng)，表明P-gp的外排功能越受抑制[22]. 本研究在hCMEC/D3和Caco-2兩種細(xì)胞系上考察了Apt5對(duì)P-gp外排功能的抑制作用，結(jié)果如圖5所示. 在hCMEC/D3中，Apt5及陽(yáng)性藥環(huán)孢菌素A均顯著地增加了胞內(nèi)羅丹明123的蓄積量，分別為40.77%，44.60%，說(shuō)明Apt5對(duì)hCMEC/D3中P-gp的外排功能有很強(qiáng)的抑制作用，且該抑制作用與陽(yáng)性藥的抑制作用相當(dāng). 在Caco-2中，Apt5及環(huán)孢菌素A也顯著地增加了胞內(nèi)羅丹明123的蓄積量，分別為32.39%，154.9%，說(shuō)明Apt5對(duì)Caco-2中P-gp的外排功能也具有較強(qiáng)的抑制作用. 本實(shí)驗(yàn)在兩種細(xì)胞系上均證明了Apt5對(duì)P-gp的外排轉(zhuǎn)運(yùn)功能有較強(qiáng)的抑制作用.

圖5 環(huán)孢菌素A，Apt5存在時(shí)hCMEC/D3及Caco-2胞內(nèi)羅丹明123的蓄積量Fig.5 Intracellular rhodamine 123 accumulation of hCMEC/D3 and Caco-2 treated with cyclosporine A or Apt5

4 結(jié) 論

本文基于SELEX技術(shù)首次篩選得到了P-gp的核酸適配體，并通過(guò)ELISA與SPR兩種方法對(duì)Apt的結(jié)合能力進(jìn)行表征，同時(shí)選擇親和性最強(qiáng)的Apt5考察其對(duì)P-gp功能的抑制作用. 結(jié)果篩選得到的10條Apt與P-gp均具有較高的結(jié)合能力. 經(jīng)過(guò)Apt的序列分析與結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)Apt與P-gp特異性結(jié)合的能力與其特定的重復(fù)序列以及徑環(huán)、口袋的結(jié)構(gòu)特征相關(guān). 且在對(duì)Apt結(jié)合能力表征的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Apt序列中的GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)可能影響Apt與P-gp的結(jié)合能力，GC質(zhì)量分?jǐn)?shù)豐富的Apt對(duì)P-gp具有較高的結(jié)合能力. 此外，在底物外排實(shí)驗(yàn)中，Apt5能顯著增加hCMEC/D3與Caco-2細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的蓄積量，對(duì)P-gp的外排功能表現(xiàn)出很強(qiáng)的抑制作用，或可成為潛在的P-gp抑制劑，這將為開(kāi)發(fā)安全、高效的新型P-gp抑制劑提供新思路.

課題組前期曾對(duì)Apt體內(nèi)抑制P-gp功能進(jìn)行了初步研究，大鼠尾靜脈注射給與Apt5和羅丹明123后，測(cè)定大鼠血漿和腦組織勻漿中羅丹明123的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，來(lái)初步評(píng)價(jià)Apt5對(duì)鼠腦P-gp外排功能的抑制效果. 結(jié)果表明Apt5能顯著增加鼠腦中羅丹明123質(zhì)量分?jǐn)?shù)，說(shuō)明Apt5具有抑制P-gp外排功能的潛力，但后續(xù)還要進(jìn)行更多的大量的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)全面考察Apt的抑制能力. 未來(lái)對(duì)Apt仍需進(jìn)行更多深入的研究，比如Apt5與P-gp的具體結(jié)合位點(diǎn)以及其抑制P-gp功能的機(jī)制等. 其次，對(duì)Apt的化學(xué)修飾也是一項(xiàng)重要的工作，比如通過(guò)硫代磷酸類(lèi)似物取代DNA的磷酸二酯鍵，或用倒置胸腺嘧啶修飾Apt的3′端，都能增加Apt對(duì)體內(nèi)核酸酶的抵抗力，延長(zhǎng)半衰期，提高體內(nèi)穩(wěn)定性[23]. Apt作為分子工具，未來(lái)還具有很多潛在的應(yīng)用價(jià)值，比如，可對(duì)Apt進(jìn)行熒光標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)生物樣本中P-gp質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析，為P-gp的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定提供新方法；也可結(jié)合各種成像系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)基于Apt的P-gp在機(jī)體內(nèi)的觀察等.