卵巢癌細(xì)胞中YTHDF2通過(guò)miRNA-146a調(diào)控EGFR的表達(dá)

摘要：N6-腺苷酸甲基化（m6A）修飾是真核細(xì)胞中RNA最常見(jiàn)的一種修飾方式，YTHDF2是m6A修飾系統(tǒng)發(fā)揮重要作用的基因。文章通過(guò)生物信息學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)合的方法，驗(yàn)證了YTHDF2通過(guò)miRNA-146a對(duì)EGFR基因表達(dá)的分子調(diào)控機(jī)制，該信號(hào)通路的闡述有助于從表觀遺傳學(xué)角度更好的解釋卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，并為卵巢癌的早期診斷和治療提供潛在的有效靶點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：卵巢癌;m6A;YTHDF2;miRNA-146a;EGFR

Abstract：N6-methyladenosine，namly m6A，acts as the most frequent modification in eucaryotic cells，and YTHDF2 play a significant role in the m6A modification complex. This article demonstratesd that YTHDF2 could modulate the expression of EGFR via miRNA-146a，using the bioinformatics combined with molecular experiments. The establishment of the signal pathway favors the molecular mechanic eluciation of ovarian cancer innitiation and progression，thereby providing a potential candidate for the eraly diagnosis and treatment of ovarian cancer.

Key words： Ovarian cancer;m6A;YTHDF2;miRNA-146a;EGFR

【中圖分類(lèi)號(hào)】R271.1?【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A?【文章編號(hào)】1673-9026（2021）13-02

1 前沿

卵巢癌是常見(jiàn)的女性惡性腫瘤之一，并且是導(dǎo)致女性癌癥死亡的第四大原因，但長(zhǎng)期以來(lái)，由于對(duì)卵巢癌分子發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)不完全且缺乏早期有臨床意義的篩查標(biāo)志物，約有50%的卵巢癌在確診時(shí)已處于晚期，導(dǎo)致總生存期較差[1]。因此，發(fā)掘卵巢癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分子驅(qū)動(dòng)因子，開(kāi)發(fā)針對(duì)早期卵巢癌的篩查方法，對(duì)于卵巢癌的早期診斷和治療具有較高臨床應(yīng)用價(jià)值。

到目前為止，在生物體中已經(jīng)鑒定出超過(guò)150種RNA修飾方式，RNA內(nèi)部修飾主要用于維持mRNA的穩(wěn)定性，常見(jiàn)的RNA修飾方式有

N6-腺苷酸甲基化（m6A）、N1-腺苷酸甲基化（m1A）、胞嘧啶羥基化（m5C）等，但m6A修飾是真核生物RNA中最常見(jiàn)的一種修飾方式[2]。哺乳動(dòng)物的RNA中大約有0.1–0.4%的腺苷酸存在m6A修飾現(xiàn)象，大約占了所有甲基化核苷酸的50%。與m6A RNA修飾相關(guān)的酶系統(tǒng)主要分為三部分：甲基化酶、去甲基化酶、甲基化相互作用蛋白，METTL3，METTL14，WTAP，RBM15/15B，KIAA1429，ZC3H13和METTL16是常見(jiàn)的甲基化酶;ALKBH5、ALKBH3、FTO是常見(jiàn)的去甲基化酶;YTHDF1，YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1、YTHDC2是常見(jiàn)的與甲基化相互作用的蛋白[3]。RNA的m6A修飾主要存在于RRm6ACH（[G/A/U][G/A]m6AC[U/A/C]）保守序列，而且主要集中在3′UTR區(qū)和長(zhǎng)的外顯子內(nèi)部[3-4]。此外，在mRNA前體（pre-mRNA）和長(zhǎng)鏈非編碼RNA中（lncRNA）存在較多的m6A修飾[4]。m6A修飾幾乎可以影響RNA代謝的每一個(gè)過(guò)程，如：RNA的轉(zhuǎn)錄、剪接、出核、降解和翻譯等生物學(xué)過(guò)程，從而調(diào)控基因表達(dá)[5]。RNA m6A修飾與多種疾病相關(guān)，包括腫瘤、神經(jīng)性疾病和胚胎發(fā)育遲緩等。

非編碼RNA是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包含rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 和microRNA等，能夠調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、細(xì)胞凋亡和自噬等多種生理過(guò)程[6]。 microRNA是一類(lèi)重要的非編碼RNA，它能夠影響多種生物學(xué)過(guò)程，比如免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和腫瘤形成等[7-8]。

m6A修飾對(duì)非編碼RNA的功能、轉(zhuǎn)運(yùn)、降解等過(guò)程產(chǎn)生調(diào)控作用[9-11]：①m6A修飾能夠調(diào)控microRNA的加工成熟過(guò)程，促進(jìn)它的降解，進(jìn)而抑制下游靶基因的表達(dá);②m6A修飾能夠影響多種與細(xì)胞增殖和致癌相關(guān)的microRNA的轉(zhuǎn)錄;③miR-106b、miR-18a/b、miR-3607、miR-423、miR-30a和miR-320b/d/e等多種microRNA上存在的m6A修飾能夠影響亞砷酸鹽誘導(dǎo)的腫瘤發(fā)生過(guò)程。

我們通過(guò)m6A在線預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)miR-146a上存在m6A修飾位點(diǎn)，YTHDF2作為m6A修飾系統(tǒng)的重要成員，是否對(duì)miR-146a發(fā)揮調(diào)控作用？此外，通過(guò)miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件分析發(fā)現(xiàn)EGFR基因是miR-146a下游潛在的作用靶點(diǎn)，那么YTHDF2是否可以通過(guò)miR-146a調(diào)控EGFR基因的表達(dá)轉(zhuǎn)錄？本研究中我們將分別對(duì)以上問(wèn)題進(jìn)行探討。

2 材料與方法

（1）細(xì)胞培養(yǎng)和RNAi實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)將采用常用的COV504（漿液性卵巢癌細(xì)胞系）和A2780（卵巢子宮內(nèi)膜樣腺癌細(xì)胞系）人卵巢癌細(xì)胞系。COV504細(xì)胞系培養(yǎng)于添加了10%FBS、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基 （Life Technologies）。A2780細(xì)胞系培養(yǎng)于添加了10%FBS、100μg/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的Eagle培養(yǎng)基（Gibco），所有細(xì)胞置于含有5%CO2的37℃濕化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

在RNAi實(shí)驗(yàn)中，使用Lipofectamine 2000進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染，實(shí)驗(yàn)過(guò)程需設(shè)置陰性對(duì)照，siRNA將由RiboBio （廣州，中國(guó)）合成。

（2）RNA提取及熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)（Quantitative real-time PCR）

使用Trizol（Invitrogen）從組織和細(xì)胞中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)使用PrimeScript RT Master Mix（Takara）。SYBR qPCR Mix（Toyobo）用于RT-PCR，采用2-ΔΔCT法評(píng)估YTHDF2和EGFR等基因的表達(dá)水平，β-actin基因用作內(nèi)參基因。

（3）miRNA的克隆、表達(dá)和檢測(cè)

按照pcDNA3.3-TOPO TA克隆試劑盒的操作說(shuō)明，將192bp的DNA片段（將包含miRNA-146a前體序列）插入哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3.3-TOPO（Invitrogen），通過(guò)測(cè)序確認(rèn)插入片段，將插入片段的新載體命名為pcDNA3.3-miR-146a。按照DOTA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染（Roche）試劑盒操作說(shuō)明，將pcDNA3.3-miR-146a載體轉(zhuǎn)入COV504和A2780卵巢癌細(xì)胞系中。48小時(shí)后，使用mirVana miRNA 提取試劑盒（Applied Biosystem）提取miRNA，使用ABI 7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystem）對(duì)成熟miR-146a進(jìn)行定量（2-ΔΔCT）。每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

3 結(jié)果

3.1卵巢癌細(xì)胞中YTHDF2基因在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控miR-146a的轉(zhuǎn)錄

我們通過(guò)SRAMP（http：//www.cuilab.cn/sramp/）對(duì)miR-146a中可能存在的m6A位點(diǎn)進(jìn)行在線預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-146a中存在1個(gè)潛在的m6A甲基化位點(diǎn)（圖 1A），且YTHDF2敲除細(xì)胞系中miR-146a的轉(zhuǎn)錄水平存在一定程度的上調(diào)（圖 1B），所以我們推測(cè)m6A識(shí)別蛋白YTHDF2通過(guò)識(shí)別miR-146a的m6A修飾位點(diǎn)，介導(dǎo)miR-146a的降解，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控miR-146a的轉(zhuǎn)錄。

3.2 EGFR是miR-146a的下游靶基因

為了確定miR-146a下游靶基因，我們通過(guò)miRmap（http：// mirmap.ezlab.org/），microT（http：//www.microrna.gr/ microT），miRanda（http：//www.microrna.org/microrna/home.do） 和 PITA（http：//genie.weizmann.ac.il/pubs/ mir07/mir07_data.html）等多種miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)miR-146a的下游靶基因，miR-146a能夠靶向結(jié)合EGFR基因（圖2A），RT-PCR（圖2B和2C）證明miR-146a的敲除和過(guò)表達(dá)均能影響EGFR的表達(dá)。

3.3 YTHDF2調(diào)控EGFR基因的表達(dá)

4 討論

文章首次從表觀遺傳學(xué)角度揭示了m6A識(shí)別蛋白YTHDF2通過(guò)miR-146a對(duì)EGFR基因的分子調(diào)控機(jī)制，該信號(hào)通路在卵巢癌中的研究在國(guó)內(nèi)外尚屬首次，該通路的建立有助于從表觀遺傳學(xué)角度更好的解釋卵巢癌的發(fā)病機(jī)制，并為卵巢癌早期診斷、臨床分期、分子分型、預(yù)后評(píng)估、PARP抑制劑耐藥機(jī)制等方面的研究提供參考，同時(shí)為卵巢癌的靶向/免疫治療提供潛在的、有效的生物標(biāo)記物。

參考文獻(xiàn)：

[1]Hua W，Zhao Y，Jin X，et al. METTL3 promotes ovarian carcinoma growth and invasion through the regulation of AXL translation and epithelial to mesenchymal transition[J]. Gynecologic Oncology，2018，151（2）： 356-365.

[2]Lan Q，Liu PY，Haase J，et al. The critical role of RNA m6A methylation in cancer[J]. Cancer Research，2019，79（7）： 1285-1292.

[3]Kane SE，Beemon K. Precise localization of m6A in Rous sarcoma virus RNA reveals clustering of methylation sites： implications for RNA processing[J]. Molecular and Cellular Biology，1985，5（9）： 2298-2306.

[4]Lan Q，Liu PY，Haase J，et al. The critical role of RNA m6A methylation in cancer[J]. Cancer Research，2019，79（7）： 1285-1292.

[5]Dai D，Wang H，Zhu L，et al. N6-methyladenosine links RNA metabolism to cancer progression[J]. Cell Death & Disease，2018，9（2）： 1-13.

[6]Fazi F，F(xiàn)atica A. Interplay between N6-methyladenosine （m6A） and non-coding RNAs in cell development and cancer[J]. Frontiers in Cell and Developmental Biology，2019，7： 116.

[7]Chen Y，Lin Y，Shu Y，et al. Interaction between N 6-methyladenosine （m 6 A） modification and noncoding RNAs in cancer[J]. Molecular Cancer，2020，19： 1-14.

[8]Yi YC，Chen X Y，Zhang J，et al. Novel insights into the interplay between m 6 A modification and noncoding RNAs in cancer[J]. Molecular Cancer，2020，19（1）： 1-10.

[9]Zhang J，Bai R，Li M，et al. Excessive miR-25-3p maturation via N 6-methyladenosine stimulated by cigarette smoke promotes pancreatic cancer progression[J]. Nature Communications，2019，10（1）： 1-15.

[10]Han J，Wang J，Yang X，et al. METTL3 promote tumor proliferation of bladder cancer by accelerating pri-miR221/222 maturation in m6A-dependent manner[J]. Molecular Cancer，2019，18（1）： 1-15.

[11]Gu S，Sun D，Dai H，et al. N6-methyladenosine mediates the cellular proliferation and apoptosis via microRNAs in arsenite-transformed cells[J]. Toxicology Letters，2018，292： 1-11.

作者簡(jiǎn)介：第一作者趙強(qiáng)，1986年出生，男，漢族，山東臨沂人，博士，現(xiàn)就職于天津市腫瘤醫(yī)院空港醫(yī)院，助理研究研員，主要從事腫瘤學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：天津市衛(wèi)生健康科技項(xiàng)目（RC20189）