綠原酸抑制TGF-β1誘導的人腎小管上皮細胞系HK-2纖維化因子表達

孫夢奎，李守林

(深圳市兒童醫(yī)院 泌尿外科，廣東 深圳 518038)

腎臟纖維化(renal fibrosis)包括腎小球硬化、腎小管萎縮、腎間質(zhì)纖維化及細胞外基質(zhì)異常分布等，是各類腎臟疾病、損傷進展到終末期時的主要病理改變之一。探索如何延緩甚至逆轉(zhuǎn)腎臟纖維化從而更好的保護腎臟功能一直是研究的熱點。綠原酸(chlorgenic acid，CGA)是由咖啡酸和奎寧酸聚合所形成的酯酸，是植物經(jīng)有氧呼吸過程產(chǎn)生的苯丙素類化合物。有報道稱其能夠有效的緩解肺[1]、肝臟[2]等器官的纖維化。但是，其對腎臟纖維化是否有影響卻暫無相關報道。腎臟纖維化的一個顯著特點就是腎小管上皮細胞表達膠原纖維蛋白Ⅰ和Ⅲ增加。本研究擬探索CGA對人腎小管上皮HK-2細胞表達纖維化因子的影響及其潛在分子機制，為臨床上治療腎臟纖維化提供幫助。

1 材料與方法

1.1 材料

人腎小管上皮細胞系HK-2(ATCC公司)；細胞培養(yǎng)基DMEM/F-12(Hyclone公司)；CCK-8試劑盒(日本同仁化學研究所)；綠原酸(Sigma-Aldrich公司)；重組人TGF-β1(PeproTech公司)；TRIzol試劑(Invitrogen公司)；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司)；目的基因上下游引物(上海生工生物工程有限公司)；TLR4(Toll-like receptor 4/nuclear factor κB)、IκBα、p-IκBα、NF-κB、p-NF-κB及GAPDH抗體(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)及分組:于含10%胎牛血清、青霉素 100 IU/mL和鏈霉素 100 IU/mL的DMEM/F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)人腎小管上皮HK-2細胞，培養(yǎng)條件為37 ℃，5% CO2細胞孵育箱中。CGA對HK-2細胞增殖的影響中，細胞分組為0、20、40、80 μg/mL的CGA分別處理細胞0、12、24、36、72 h，共20組。后續(xù)實驗分組：對照組(磷酸鹽緩沖液處理48 h)，TGF-β1組(5 ng/mL人重組TGF-β1處理48 h)。CGA組(20、40、80 μg/mL的CGA處理48 h)。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖:將處于對數(shù)增殖期的HK-2細胞混懸液以2×104個/mL接種于96孔板，每孔100 μL。靜置24 h待細胞貼壁后，用100 μL的細胞培養(yǎng)基DMEM/F-12與10 μL的CCK-8試劑混勻，加入各孔之中并與細胞孵育1 h，在激發(fā)波長設為450 nm的酶標儀下測定各孔吸光度值(absorbance value，A)。

1.2.3 Real-time PCR檢測mRNA表達:收集各組HK-2細胞，添加Trizol細胞裂解液1 mL提取總RAN。用分光光度計檢測RNA吸光度值。波長在260 nm的吸光值/280 nm的吸光度值(A260/A280)位于1.8～2.1為合格樣本，可用于后續(xù)實驗。根據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，用20 μL反應體系進行反轉(zhuǎn)錄，獲得模板cDNA。采用20 μL反應體系以上述cDNA為模板進行擴增。其中cDNA為4 μL，上、下游引物分別為1 μL，SYBR混合物10 μL，超純水4 μL。反應條件：95 ℃預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，共計30個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量。上下游目的基因引物。Collagen Ⅰ上游序列5′-GCCAAGACGAAGACATCCCA-3′，下游序列5′-CACCATCATTTCCACGAGCA-3′；collagen Ⅲ上游序列5′-GAGCTGGCTACTTCTCGCTC-3′，下游序列5′-CCTTGACCATTAGGAGGGCG-3′；E-cadherin上游序列5′-GGGGTCTGTCATGGAAGGTG-3′，下游序列5′-CAAAATCCAAGCCCGTGGTG-3′；α-SMA 上游序列5′-AAAGCAAGTCCTCCAGCGTT-3′，下游序列5′-TTAGTCCCGGGGATAGGCAA-3′；vimentin上游序列5′-CCGCACATTCGAGCAAAGAC-3′，下游序列5′-AAGCGCACCTTGTCGATGTA-3′；TGF-β1上游序列5′-ATGGTGGAAACCCACAACGA-3′,下游序列5′-ATGACACAGAGATCCGCAGTC-3′；snail上游序列5′-CGAGTGGTTCTTCTGCGCTA-3′,下游序列5′-GG GCTGCTGGAAGGTAAACT-3′；slug上游序列5′-AC GCCTCCAAAAAGCCAAAC-3′,下游序列5′-ACTC ACTCGCCCCAAAGATG-3′；GAPDH上游序列5′-TT GCAACCGGGAAGGAAATG-3′，下游序列5′-TGGA ATTTGCCATGGGTGGA-3′。

1.2.4 免疫熒光檢測細胞膠原纖維的表達:將處于對數(shù)增殖期的HK-2細胞混懸液以2×104個/mL接種于6孔板爬片。4%多聚甲醛固定10 min，0.5%的Triton X-100透膜10 min，向玻片滴加山羊血清封閉30 min,然后滴加一抗孵育過夜。Collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的濃度均為1∶50。向玻片上滴加熒光二抗，濕盒中避光孵育1 h。滴加DAPI避光孵育5 min，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，紅色熒光為陽性表達。每張切片隨機取5個視野，采用Image Pro Plus 6.0圖像處理分析軟件計算高倍鏡視野下熒光密度值。

1.2.5 Western blot檢測目的蛋白表達:添加RIPA裂解HK-2細胞并提取總蛋白，使用BCA法進行蛋白定量。制備SDS/PAGE凝膠，各孔加入20 μL蛋白樣。電泳分離蛋白，電轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維素膜。5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入抗體TLR4(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、IκBα(1∶1 000)、p-NF-κB(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)及GAPDH(1∶1 000)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，5 min/次。添加二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h。TBST洗膜3次，5 min/次。采用ECL化學發(fā)光和曝光顯影。以GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度的綠原酸(CGA)對HK-2細胞增殖的影響

各濃度(0、20、40、80 μg/mL)綠原酸組細胞增殖之間無顯著差異(表1)。

表1 CGA對HK-2細胞增殖的影響Table 1 Effect of chlorogenic acid on proliferation of HK-2 cells

2.2 CGA對TGF-β1誘導的HK-2細胞表達纖維化相關基因及蛋白的影響

與對照組相比，TGF-β1組collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA、vimentin、TGF-β1、snail及slug 表達增加，而E-cadherin 表達降低(P<0.01)。與TGF-β1組相比，不同濃度的CGA能夠降低collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、α-SMA、vimentin、TGF-β1、snail及slug表達，而增加E-cadherin 表達(P<0.01)(圖1～2，表2～4)。

表2 CGA對HK-2 細胞collagen Ⅰ、collagen Ⅲ、E-cadherin及α-SMA mRNA表達的影響Table 2 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅰ,collagen Ⅲ,E-cadherin and α-SMA expression of HK-2 cells in mRNA level

表3 CGA對HK-2 細胞vimentin、TGF-β1、snail及slug mRNA表達的影響Table 3 Effect of chlorogenic acid on vimentin,TGF-β1,snail and slug mRNA expression of HK-2 cells in mRNA level

表4 CGA對HK-2 細胞collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表達的影響Table 4 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅰ and collagen Ⅲ expression of HK-2 cells

圖1 CGA對HK-2細胞collagen Ⅰ表達的影響Fig 1 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅰ expression of HK-2 cells

圖2 CGA對HK-2細胞collagen Ⅲ表達的影響Fig 2 Effect of chlorogenic acid on collagen Ⅲ expression of HK-2 cells

2.3 CGA對TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

與對照組相比，TGF-β1組TLR4、p-IκBα及p-NF-κB蛋白表達量增加(P<0.01)。與TGF-β1組相比，綠原酸(80 μg/mL)組的HK-2細胞TLR4、p-IκBα及p-NF-κB蛋白表達量明顯降低(P<0.01)(圖3，表5)。

表5 CGA對TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響Table 5 The effect of chlorogenic acid on expression of TLR4/NF-κB signal pathway related protein

圖3 CGA對TLR4/NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響Fig 3 Effect of chlorogenic acid on expression of TLR4/NF-κB signal pathway related protein

3 討論

腎臟纖維化是所有慢性腎病或損傷如慢性腎小球腎炎、糖尿病腎病等發(fā)展至終末期腎病的共同病理改變。截至目前，腎臟纖維化的機制尚未完全明了。尋找有效的抗腎臟纖維化手段是目前的研究熱點。

CGA廣泛分布于各類植物中，多項研究表明，CGA具有抗氧化[3]、抗腫瘤[4]的功能。除此之外，研究表明CGA能夠有效的抑制肝臟纖維化，其具體機制與調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad7信號通路[2]、抑制TLR4/MyD88/NF-κB 信號通路均有關系[5]。但是，CGA是否能夠抑制腎小管纖維化卻并無報道。

TGF-β1誘導HK-2細胞分泌纖維化因子是常用的腎臟纖維化細胞模型[6]。Collagen Ⅰ和collagen Ⅲ是腎間質(zhì)重要的細胞基質(zhì)成分，隨著腎臟纖維化的進展，含量會顯著增加[7]。細胞外基質(zhì)出現(xiàn)異常積聚是腎臟纖維化特征性的表現(xiàn)之一，部分源自于腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞的合成和分泌[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1預處理后的人腎小管上皮HK-2細胞collagen Ⅰ和collagen Ⅲ表達增加，綠原酸處理HK-2細胞，能夠降低collagen Ⅰ和collagen Ⅲ的表達，減少細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，抑制腎臟纖維化。

研究表明，腎臟纖維化時腎小管細胞能夠向間質(zhì)細胞分化，轉(zhuǎn)變?yōu)槌衫w維細胞，成為細胞外基質(zhì)的一個重要來源[9]。上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化表現(xiàn)為細胞黏附分子E-cadherin表達降低，α-SMA表達增加，細胞骨架發(fā)生變化，vimentin表達增加，snail、slug表達增加[10-11]。本研究中，CGA能夠有效的抑制TGF-β1誘導的HK-2細胞上皮間質(zhì)化，從而抑制腎小管上皮纖維化。

有研究證實TLR4/NF-κB信號通路參與腎臟纖維化[12]。臍帶來源的間充質(zhì)干細胞的條件培養(yǎng)基能夠抑制TLR4/NF-κB信號通路，從而保護大鼠部分輸尿管梗阻導致的腎小管上皮的纖維化[13]。所以抑制TLR4/NF-κB信號通路，能夠有效的保護腎小管上皮細胞，減少細胞纖維化。同時，大量研究表明，CGA能夠有效的抑制TLR4/NF-κB信號通路的激活[5]。本研究證實，CGA能有效的抑制TLR4/NF-κB信號通路。

綜上所述，CGA能夠有效的抑制TGF-β1誘導的人腎小管上皮HK-2細胞分泌纖維化因子，其分子機制與抑制TLR4/NF-κB信號通路激活有關。