lncRNA RAB11B-AS1上調miR-628-3p抑制人胃癌細胞系增殖和遷移

楊寧波，賈曉東，寇 耀

(遂寧市中心醫(yī)院 胃腸外科，四川 遂寧 629000)

胃癌是常見的消化道腫瘤之一，化學藥物治療(簡稱化療)是胃癌的重要治療方式之一，然而化療耐藥是導致化療效果不佳或失敗的重要原因，因此，提高癌細胞對化療藥物的敏感性對提高臨床化療療效意義重大[1]。而深入研究腫瘤細胞的耐藥分子機制可為提高胃癌細胞對化療藥物的敏感性提供有效策略。lncRNA廣泛地參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，且參與調控胃癌的增殖、轉移和耐藥發(fā)生等[2]。如lncRNA RAB11B-AS1在胃癌組織中高表達，可作為胃癌診斷和預后評估的潛在分子標志物[3]。lncRNA RAB11B-AS1在體外可增加乳腺癌細胞的遷移和侵襲，并促進腫瘤血管生成和乳腺癌遠處轉移[4]。然而lncRNA RAB11B-AS1對胃癌細胞惡性生物學行為的影響及機制尚不清楚。研究顯示，miRNA與胃癌增殖、侵襲、轉移、預后及化療耐藥等密切相關[5]。提高miR-628-3p表達水平能抑制HGC-27細胞增殖，使細胞周期阻滯于G1期及S期，且促進細胞凋亡[6]。而miR-628-3p對胃癌HGC-27細胞順鉑耐藥性的影響尚不清楚。因此，本實驗旨在研究lncRNA RAB11B-AS1是否通過調控miR-628-3p影響胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及順鉑耐藥性。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃黏膜細胞系GES-1和胃癌細胞系HGC-27(ATCC公司)；RPMI-1640培養(yǎng)基(上海浩然生物技術有限公司)；順鉑(上海北諾生物科技有限公司)；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)；實時熒光定量PCR檢測試劑盒(TaKaRa公司)；RIPA蛋白裂解液、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)；Transwell小室、Matrigel(Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 順鉑耐藥胃癌細胞系的建立：HGC-27用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，取對數增殖期HGC-27細胞，依次用濃度為0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L的順鉑培養(yǎng)存活細胞，每一濃度連續(xù)傳代3次；將在0.4 mg/L濃度下存活的細胞命名為HGC-27/DDP。

1.2.2 細胞的轉染與分組：取對數生長期HGC-27/DDP的細胞，將si-NC、si-RAB11B-AS1轉染至HGC-27/DDP細胞中，分別記為si-NC組、si-RAB11B-AS1組；正常培養(yǎng)的HGC-27/DDP細胞作為對照組。

1.2.3 MTT法檢測細胞存活率：取分別用0.025、0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L順鉑培養(yǎng)的HGC-27、HGC-27/DDP細胞，對照組細胞不作任何處理，按試劑盒說明操作，檢測490 nm處吸光度值(A)。實驗組與對照組A值的比值為細胞存活率；其他各組細胞存活率均按上述方法進行。

1.2.4 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測RAB11B-AS1和miR-628-3p的表達水平：提取培養(yǎng)48 h細胞的總RNA，反轉錄合成cDNA，以GAPDH和U6為內參進行PCR，相對表達量用2-△△Ct法計算。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞周期：培養(yǎng)各組細胞48 h后收集細胞，并制備單細胞懸液，按試劑盒說明操作，上機檢測激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，重復3次。用流式細胞儀和DNA細胞周期分析軟件進行檢測分析。

1.2.6 Transwell小室法檢測細胞遷移和侵襲：遷移實驗：將無血清培養(yǎng)的200 μL細胞懸液加入到Transwell上室，下室加含血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，然后用結晶紫染色，顯微鏡下拍照計數。侵襲實驗：用Matrigel包被Transwell上室，其余同遷移實驗。

1.2.7 蛋白質印跡(Western blot)檢測Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白表達：提取細胞總蛋白，定量后進行SDS-PAGE，轉膜，封閉，加入一抗和二抗孵育，加入化學發(fā)光試劑顯影，定影，成像，檢測蛋白條帶吸光度，計算蛋白表達水平。

1.2.8 雙熒光素酶報告實驗檢測RAB11B-AS1和miR-628-3p的靶向關系：使用PCR擴增包含miR-628-3p結合位點的RAB11B-AS1序列片段，并構建至熒光素酶表達載體中，獲得RAB11B-AS1野生型載體(WT-RAB11B-AS1)，將RAB11B-AS1序列AC UUACUAGA突變?yōu)锳GCACAAGCC，獲得RAB11B-AS1突變型載體(MUT-RAB11B-AS1)，將其分別與miR-NC和miR-628-3p共轉染至HGC-27/DDP細胞中，按說明書檢測熒光素酶活性。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 順鉑藥物對HGC-27和HGC-27/DDP細胞存活率的影響

與對照組相比，0.2、0.4 mg/L順鉑處理后HGC-27細胞存活率顯著降低(P<0.05)，而0～0.4 mg/L順鉑處理后HGC-27/DDP細胞存活率無顯著變化(表1)。表明胃癌順鉑耐藥細胞建立成功。

表1 順鉑藥物對HGC-27和HGC-27/DDP細胞存活率的影響Table 1 Effect of cisplatin drugs on the survival rate of HGC-27 and HGC-27DDP

2.2 RAB11B-AS1在HGC-27、HGC-27/DDP中的表達

與GES-1相比，胃癌細胞HGC-27和胃癌順鉑耐藥細胞HGC-27/DDP中RAB11B-AS1表達水平顯著升高(P<0.05)，且HGC-27/DDP中RAB11B-AS1表達水平顯著高于胃癌細胞HGC-27(P<0.05)(表2)。

表2 RAB11B-AS1在HGC-27、HGC-27/DDP細胞中的表達Table 2 Expression of RAB11B-AS1 in HGC-27 and

2.3 干擾RAB11B-AS1對HGC-27/DDP增殖、遷移、侵襲的影響

與對照組組和si-NC組相比，si-RAB11B-AS1組G0-G1期細胞所占比例顯著升高，S期細胞所占比例顯著降低(P<0.05)，G2-M期細胞所占比例無變化；細胞存活率顯著降低，遷移、侵襲細胞數顯著降低(P<0.05)(表3)。

表3 干擾RAB11B-AS1對HGC-27/DDP增殖遷移侵襲的影響Table 3 Effect of RAB11B-AS1 interference on proliferation,migration and invasion of

2.4 干擾RAB11B-AS1對HGC-27/DDP細胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin表達的影響

與對照組組和si-NC組相比，si-RAB11B-AS1組RAB11B-AS1表達水平顯著降低，Ki67、N-cadherin表達水平顯著降低，E-cadherin表達水平顯著升高(P<0.05)(表4,圖1)。

圖1 Western blot檢測Ki67、E-cadherin、N-cadherin蛋白的表達Fig 1 Western blot detection of Ki67,E-cadherin and N-cadherin protein expression

表4 干擾RAB11B-AS1對HGC-27/DDP細胞中Ki67、E-cadherin、N-cadherin表達的影響Table 4 Effect of interference with RAB11B-AS1 on the expression of Ki67,E-cadherin and N-cadherin

2.5 RAB11B-AS1靶向調控miR-628-3p

RAB11B-AS1與miR-628-3p存在結合位點(圖2)。miR-628-3p與WT-RAB11B-AS1轉染的細胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)(表5)。si-RAB11B-AS1組miR-628-3p表達水平為2.77±0.07，顯著高于0.98±0.05(P<0.05)。

表5 雙熒光素酶報告實驗Table 5 Dual luciferase report

圖2 RAB11B-AS1靶向miR-628-3pFig 2 RAB11B-AS1 targeted miR-628-3p

3 討論

順鉑(cisplatin，DDP)是臨床上應用廣泛的化療藥物，其存在一定副作用，且其耐藥性的產生使其療效大大減弱[7]。胃癌細胞也易對順鉑產生耐藥性，為研究胃癌細胞的順鉑耐藥性的分子機制，本實驗建立胃癌順鉑耐藥細胞株HGC-27/DDP，在順鉑濃度大于0.2 mg/L時胃癌細胞HGC-27的存活率顯著降低，而HGC-27/DDP細胞的存活率在順鉑濃度為0.4 mg/L時也無顯著變化，說明HGC-27/DDP相比HGC-27細胞更耐藥，耐藥細胞株建立成功。

LncRNA參與調控胃癌的發(fā)生發(fā)展過程，且lncRNA還可影響胃癌的順鉑耐藥性，如lncRNA UCA高表達會促進胃癌順鉑耐藥[8-9]。LncRNA MEG3過表達可增加胃癌細胞對順鉑的敏感性[10]。本實驗結果顯示，RAB11B-AS1在胃癌細胞HGC-27和HGC-27/DDP中高表達，且HGC-27/DDP細胞中RAB11B-AS1表達水平高于HGC-27細胞；提示RAB11B-AS1或與胃癌細胞順鉑耐藥性相關。本實驗進一步通過干擾RAB11B-AS1，結果顯示，G0/G1期細胞所占比例升高，S期細胞所占比例降低；細胞存活率降低，遷移、侵襲細胞數降低，Ki67、N-cadherin表達水平降低，E-cadherin表達水平升高。Ki67是一種細胞增殖核抗原，與細胞增殖息息相關，且研究還發(fā)現Ki67的表達與胃癌患者TNM分期，淋巴結轉移相關[11]。E-cadherin、N-cadherin是上皮間質轉化相關標志物，其表達水平與胃癌轉移相關[12]。因此，本實驗結果說明干擾RAB11B-AS1可抑制HGC-27/DDP細胞增殖、遷移、侵襲，且阻滯細胞周期，表明干擾RAB11B-AS1可提高HGC-27細胞對順鉑的敏感性。

本實驗研究RAB11B-AS1對胃癌細胞的影響的進一步的可能作用機制，通過Starbase數據庫預測其可能的靶miRNA，結果顯示，RAB11B-AS1與miR-628-3p存在結合位點，且證實RAB11B-AS1可靶向調控miR-628-3p的表達。研究報道m(xù)iR-628-3p可抑制HGC-27細胞增殖，促進細胞凋亡[6]。且miR-628-3p可促進肺癌細胞凋亡并抑制肺癌A549細胞遷移[13]。miR-628可抑制急性髓性白血病細胞增殖，并在體外誘導細胞周期停滯和凋亡[14]。提示，RAB11B-AS1對胃癌細胞的影響可能與miR-628-3p表達有關。

綜上所述，抑制lncRNA RAB11B-AS1可能通過上調miR-628-3p抑制胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并提高對順鉑的敏感性。