腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白6缺失減緩CCl4誘發(fā)的小鼠肝臟纖維化進(jìn)程

蔡歡嫦，周丹茹，史天靜，尹亞軍，張大偉，張 瑾

(嘉興學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 嘉興 314001)

肝纖維化(liver fibrosis)是胞外基質(zhì)過度積累的病理生理學(xué)過程，由持續(xù)的肝損傷和異常修復(fù)程序引起，不斷發(fā)展將轉(zhuǎn)變?yōu)楦斡不酥粮伟1-2]。近年來發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞與肝纖維化進(jìn)程關(guān)系密切，自然殺傷細(xì)胞(natural killer，NK)和1型輔助性T細(xì)胞(T helper type 1 cells,Th1)抑制肝纖維化，而巨噬細(xì)胞(macrophage)和2型輔助性T細(xì)胞(T helper type 2 cells,Th2)起促進(jìn)作用[3]。因此，相關(guān)功能分子的探究將是纖維化干預(yù)的重要理論基礎(chǔ)。補(bǔ)體C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白6(complement C1q/tumor necrosis factor-related protein 6,CTRP6)是調(diào)控脂肪細(xì)胞增殖與分化、三酰甘油積累和脂肪酸氧化等過程的新型脂肪因子[4-5]。它參與機(jī)體免疫細(xì)胞分布的調(diào)節(jié)，并通過改變IL-10、TNF-α和IL-1β等細(xì)胞因子的水平影響免疫應(yīng)答[6-7]。盡管研究顯示CTRP6缺陷致使肝癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移受到抑制[8]，但對(duì)其調(diào)控肝癌免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和肝病進(jìn)程的認(rèn)識(shí)仍不清楚。本研究通過分析肝纖維化CTRP6敲除小鼠的病理學(xué)與分子表達(dá)特點(diǎn)，揭示CTRP6在肝病發(fā)展進(jìn)程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：8周齡體質(zhì)量相近雄性野生型(CTRP6+/+)和敲除型(CTRP6-/-)小鼠共計(jì)24只，以C57BL/6J為遺傳背景，CTRP6基因敲除小鼠委托劍橋基因組中心(蘇州大學(xué))構(gòu)建，飼養(yǎng)于嘉興學(xué)院醫(yī)學(xué)院SPF級(jí)鼠房，條件為(25±1)℃，40%～60%相對(duì)濕度，12 h明暗循環(huán)照明。

1.1.2 主要試劑：康仕蘭特級(jí)初榨橄欖油(Aceites Ybarra S.A.)；四氯化碳(江蘇強(qiáng)盛功能化學(xué)股份有限公司)；丙二醛(malonic dialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；RNA提取試劑Trizol(Invitrogen公司)；HiFiScript gDNA Removal cDNA合成試劑盒和Plus SYBR real-time PCR mixture(康為世紀(jì)生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組與造模：將2種基因型小鼠進(jìn)行隨機(jī)分組，每組6只，分別為CTRP6+/+(橄欖油)、CTRP6-/-(橄欖油)、CTRP6+/+(CCl4)和CTRP6-/-(CCl4)。CCl4灌胃劑量為每克小鼠體質(zhì)量10 μL，給藥濃度為0.2%，以橄欖油稀釋，每隔兩天給藥1次，持續(xù)給藥1個(gè)月；橄欖油處理組只灌胃等體積橄欖油。

1.2.2 測(cè)定肝臟指數(shù)與病理學(xué)觀察：乙醚麻醉處死后，稱量小鼠體質(zhì)量，并解剖，肝臟組織稱重，計(jì)算公式為：肝臟指數(shù)=肝臟濕質(zhì)量(g)/小鼠體質(zhì)量(g)×100%。然后，分割肝臟組織，一部分組織于-80 ℃凍存，一部分組織用4% PFA固定。將固定的肝臟組織樣送至浙江省榮軍醫(yī)院，由其病理科完成石蠟包埋、切片和HE染色，并利用萊卡光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.2.3 纖維化及細(xì)胞增殖標(biāo)志基因表達(dá)水平的檢測(cè)：分離小部分凍存于-80 ℃的肝臟組織，經(jīng)組織研磨儀破碎裂解，按照Trizol操作說明進(jìn)行RNA提取；然后，利用核酸測(cè)定儀檢測(cè)RNA濃度，并根據(jù)試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。通過熒光實(shí)時(shí)定量PCR(RT-qPCR)對(duì)纖維化(Acta2、Col1a1、Mmp2、TGF-β和TNF-α)和細(xì)胞增殖標(biāo)志基因(CyclinD、CyclinE和CDK6)進(jìn)行相對(duì)定量，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算。檢測(cè)基因與對(duì)應(yīng)引物序列見表1。

表1 熒光實(shí)時(shí)定量PCR引物Table 1 Real-time fluorescent quantitative PCR primers

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肝臟指數(shù)的分析

與橄欖油組的CTRP6+/+小鼠相比，CCl4處理組的CTRP6+/+小鼠肝臟指數(shù)增加顯著(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with CTRP6+/+ olive oil group圖1 CTRP6對(duì)CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝臟指數(shù)的影響Fig 1 Effect of CTRP6 on mice liver index in CCl4-

2.2 肝臟中CTRP6表達(dá)水平的分析

與橄欖油組的CTRP6+/+小鼠相比，CCl4處理組的CTRP6+/+小鼠肝臟中CTRP6基因表達(dá)升高2倍(P<0.001)，而在CTRP6-/-小鼠肝臟不存在CTRP6基因表達(dá)(P<0.001)(圖2)。

*P<0.001 compared with CTRP6+/+ olive oil group圖2 CTRP6在CCl4誘導(dǎo)損傷肝臟中的表達(dá)Fig 2 Expression of CTRP6 in injured liver induced

2.3 肝臟病理與生化指標(biāo)的分析

在肝臟組織切片的HE染色中，相比于橄欖油組，CCl4處理組的CTRP6+/+和CTRP6-/-小鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的肝臟病變，其中CTRP6+/+小鼠肝組織病變更為嚴(yán)重，表現(xiàn)出更多的壞死，肝細(xì)胞疏松、腫脹，細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則(圖3A)。同時(shí)，CCl4處理組的小鼠肝臟內(nèi)丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量明顯升高(P<0.01)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力顯著降低(P<0.01)；此外，CCl4處理組中CTRP6-/-小鼠肝臟內(nèi)SOD活力降低程度顯著弱于CTRP6+/+小鼠(P<0.05)(圖3B,C)。

A.liver tissue section stained by HE;B.MDA content in liver tissue;C.SOD content in liver tissue;*P<0.01 compared with CTRP6+/+ olive oil group;#P<0.05 compared with CTRP6+/+ CCl4 group圖3 CTRP6缺失對(duì)肝臟病理與生化指標(biāo)的影響Fig 3 Effect of CTRP6 deletion on liver pathological and biochemical indexes n=6)

2.4 纖維化標(biāo)志基因表達(dá)的分析

與橄欖油組相比，CCl4處理組的CTRP6+/+和CTRP6-/-小鼠肝臟組織都表現(xiàn)為纖維化標(biāo)志基因Acta2、Col1a1、Mmp2和TGF-β的顯著高表達(dá)(P<0.01)；但CTRP6-/-小鼠的纖維化標(biāo)志基因表達(dá)水平明顯低于CTRP6+/+小鼠(P<0.05)；此外，炎性因子TNF-α表達(dá)水平分析顯示，CTRP6-/-小鼠肝臟組織TNF-α水平低于CTRP6+/+小鼠(P<0.05)(圖4)。

A.relative Acta2 transcription;B.relative Col1a1 transcription;C.relative Mmp2 transcription;D.relative TGF-β transcription;E.relative TNF-α transcription;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 compared with CTRP6+/+ olive oil group;#P<0.05,##P<0.01 compared with CTRP6+/+ CCl4 group圖4 CTRP6缺失對(duì)纖維化標(biāo)志基因表達(dá)的影響Fig 4 Effect of CTRP6 deletion on the expression of fibrosis markers n=6)

2.5 細(xì)胞增殖標(biāo)志基因表達(dá)的分析

與橄欖油組相比，CCl4處理組的CTRP6+/+小鼠肝臟組織的細(xì)胞增殖標(biāo)志基因CyclinD、CyclinE和CDK6顯著高表達(dá)(P<0.01)；但CTRP6-/-小鼠未出現(xiàn)類似變化趨勢(shì)，且這3個(gè)基因的表達(dá)水平顯著低于CTRP6+/+小鼠(P<0.01)(圖5)。

A.relative Cyclin D transcription;B.relative Cyclin E transcription;C.relative CDK6 transcription;*P<0.01 compared with CTRP6+/+ olive oil group;#P<0.01 compared with CTRP6+/+ CCl4 group圖5 CTRP6缺失對(duì)細(xì)胞增殖標(biāo)志基因表達(dá)的影響Fig 5 Effect of CTRP6 deletion on the expression of cell proliferation markers n=6)

3 討論

肝纖維化是繼慢性肝損傷和炎性反應(yīng)之后的一種愈傷反應(yīng)，嚴(yán)重威脅著人類健康。因此解析影響肝纖維化進(jìn)程的關(guān)鍵分子對(duì)干預(yù)與治療方案的提出是必要的。

研究發(fā)現(xiàn)CTRP6在肝癌組織與細(xì)胞中顯著高表達(dá)，其缺失導(dǎo)致肝癌細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖與遷移[8]；且它在小鼠肝臟的水平因高脂飲食增加，而敲降后減弱肝臟的脂肪沉積[5]。本研究發(fā)現(xiàn)CTRP6-/-小鼠表現(xiàn)為更高抗氧化能力和低水平的脂質(zhì)過氧化程度，即相對(duì)高水平的SOD和低水平的MDA，而這一結(jié)果與高糖誘導(dǎo)下CTRP6敲降的腎小球系膜細(xì)胞呈現(xiàn)低水平活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)一致[9]。此外，CTRP6-/-小鼠在病理切片分析上顯示相對(duì)低的纖維化程度。以上研究表明CTRP6參與肝病的發(fā)生與發(fā)展，而這可能與它調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)。

已有研究證實(shí)CTRP6與腎纖維化相關(guān)，但在調(diào)節(jié)腎小球系膜細(xì)胞胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)積累方面，兩個(gè)課題組獲得了相反的結(jié)果[9,11]。本研究檢測(cè)到ECM沉積標(biāo)志基因在CTRP6-/-小鼠肝臟組織是顯著低表達(dá)的，與報(bào)道的高糖誘導(dǎo)發(fā)現(xiàn)類似。這種差異效應(yīng)可能與細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)或者其受到的刺激條件有關(guān)。在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性炎性反應(yīng)模型中，CTRP6-/-小鼠的炎性因子TNF-α水平顯著低于CTRP6+/+小鼠[6]，與CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型一致。因此，可以明確CTRP6缺失降低CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝ECM沉積和炎性反應(yīng)。

肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)活化與增殖是肝纖維化的中心事件[12]。在肝癌細(xì)胞Hep3B敲降CTRP6的研究發(fā)現(xiàn)，CTRP6缺陷抑制細(xì)胞存活而促進(jìn)凋亡[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，在CCl4誘導(dǎo)條件下，CTRP6-/-小鼠肝臟中細(xì)胞增殖基因CyclinD、CyclinE和CDK6表達(dá)水平低于CTRP6+/+小鼠；同時(shí)，能夠活化HSCs和增加ECM分泌的細(xì)胞因子TGF-β表達(dá)呈現(xiàn)類似趨勢(shì)。因此，這些分子水平的差異暗示，CTRP6基因缺失對(duì)小鼠肝纖維化進(jìn)程的抑制可能與HSCs的增殖與活化狀態(tài)關(guān)聯(lián)。

綜上，CTRP6基因缺失減緩CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化進(jìn)程，而這與肝損傷過程中纖維化和細(xì)胞增殖基因的異常表達(dá)相關(guān)，提示下調(diào)CTRP6的表達(dá)可能成為干預(yù)和治療肝纖維化的潛在方法。