TREM2過(guò)表達(dá)減輕大鼠顱腦創(chuàng)傷后的認(rèn)知缺陷

楊 齊，許 峰，焦 陽(yáng)，張 賽，孫中磊,*

(1.棗莊礦業(yè)集團(tuán)中心醫(yī)院 神經(jīng)外科，山東 棗莊 277000；2.武警特色醫(yī)學(xué)中心，天津市神經(jīng)創(chuàng)傷修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300162)

神經(jīng)炎性反應(yīng)被定義為對(duì)不同類(lèi)型的顱腦創(chuàng)傷(traumatic brain injurie，TBI)所作出的先天免疫系統(tǒng)的激活反應(yīng)。腦實(shí)質(zhì)中的小膠質(zhì)細(xì)胞激活是神經(jīng)炎性反應(yīng)的標(biāo)志，被認(rèn)為是神經(jīng)元命運(yùn)的關(guān)鍵因素[1]。神經(jīng)炎性反應(yīng)與包括TBI后認(rèn)知障礙在內(nèi)的各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[2]。髓細(xì)胞觸發(fā)受體2(triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2)是TREM家族的I型跨膜先天免疫受體，在大腦中主要在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，在小膠質(zhì)細(xì)胞激活和存活中起著重要作用[3-4]。雖然小膠質(zhì)細(xì)胞是參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性反應(yīng)的主要細(xì)胞類(lèi)型之一，但是根據(jù)不同的疾病和狀況，它對(duì)神經(jīng)元的作用不同[5]。盡管已廣泛報(bào)道TREM2調(diào)節(jié)神經(jīng)炎性反應(yīng)，但未見(jiàn)報(bào)道其在TBI中的作用。本研究旨在探討TREM2過(guò)表達(dá)對(duì)大鼠TBI后認(rèn)知功能障礙的影響及其對(duì)神經(jīng)炎性反應(yīng)的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠80只，24～26月齡，體質(zhì)量600～700 g(北京維通利華生物技術(shù)有限公司)SCXK(京)2016-0011，飼養(yǎng)環(huán)境為清潔級(jí)動(dòng)物室(SPF級(jí))。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序均按照武警特色醫(yī)學(xué)中心的動(dòng)物指南進(jìn)行。

1.1.2主要試劑：Trizol試劑盒(Invitrogen公司)；ReverTra Ace RT-qPCR試劑盒(Toyobo公司)；Anti Aβ1-42(amyloid β1-42)、Anti tau、Anti TREM2、Anti iNOS、Anti Arg-1和Anti β-actin(Abcam 公司)；TREM2、IL-1β、IL-6、IL-4和IL-10 mRNA試劑盒(Sigma-Aldrich公司)；RIPA緩沖液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；編碼TREM2的慢病毒載體和對(duì)照慢病毒載體(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；SYBR Green實(shí)時(shí)PCR預(yù)混試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物的分組及處理：將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(n=8)和TBI 2、5、7、14和28 d組(n=8)，采用皮質(zhì)撞擊致傷法建立大鼠TBI模型，余32只大鼠隨機(jī)分為4組(n=8)：對(duì)照組、TBI組、(TBI+Null)組和(TBI+TREM2)組，按文獻(xiàn)所述，(TBI+Null)組腦室內(nèi)注射對(duì)照慢病毒載體，(TBI+TREM2)組腦室內(nèi)注射等量編碼TREM2的慢病毒載體，在對(duì)應(yīng)天數(shù)安樂(lè)死，取腦組織用于下一步研究[6-7]。

1.2.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)記憶功能：實(shí)驗(yàn)第24～28 d，通過(guò)Morris水迷宮試驗(yàn)觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。

1.2.3 RT-qPCR檢測(cè)mRNA：按照使用說(shuō)明，使用Trizol試劑從小鼠腦組織中收獲總mRNA，按照表1中引物序列，使用RT-qPCR試劑盒合成cDNA，SYBR Green實(shí)時(shí)PCR預(yù)混試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄酶RT-qPCR分析，StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀實(shí)時(shí)定量分析mRNA，以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences of PCR

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白：將腦組織破碎后使用RIPA緩沖液從腦組織中收集蛋白質(zhì)，BCA法測(cè)定蛋白總濃度，利用SDS-PAGE，電泳后，半干轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上。使用5%脫脂牛奶在室溫下封閉膜2 h，然后在4 ℃下分別與一抗(anti TREM2、anti iNOS、anti Arg-1、Aβ1-42、anti tau和anti β-actin)孵育過(guò)夜。用TBST洗滌后將膜與山羊抗兔二抗(1∶2 000)在室溫下孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)(ECL試劑盒)檢測(cè)免疫反應(yīng)性條帶，并使用ImageJ 1.42q軟件程序分析圖像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TREM2在TBI大鼠中上調(diào)

TBI組TREM2 mRNA及蛋白質(zhì)水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，且TREM2 mRNA和蛋白水平的峰值均出現(xiàn)在TBI后3 d(圖1A～C)。

A.TREM2 and β-actin Western blot bands;B.quantification of TREM2 protein expression;C.quantification of TREM2 mRNA expression;*P<0.05,**P<0.01 compared with control group圖1 各組大鼠TREM2蛋白和mRNA表達(dá)水平Fig 1 Expression levels of TREM2 protein and mRNA in each n=8)

2.2 TREM2過(guò)表達(dá)減輕了TBI大鼠的認(rèn)知缺陷

與對(duì)照組相比，第28天 TBI組和(TBI+Null)組大鼠的逃避潛伏期顯著延長(zhǎng)(P<0.05)；與(TBI+Null)組相比，(TBI+TREM2)的逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)(表2)。

表2 各組大鼠逃避潛伏期Table 2 Escape latency of rats in each n=8)

2.3 TREM2過(guò)表達(dá)改變了TBI大鼠腦組織的小膠質(zhì)細(xì)胞表型

與對(duì)照組相比，TBI組和(TBI+Null)大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞M1型標(biāo)志物iNOS表達(dá)水平升高，小膠質(zhì)細(xì)胞M2型標(biāo)志物Arg-1表達(dá)水平下降(P<0.05)；與TBI組相比，(TBI+TREM2)組大鼠腦組織小膠質(zhì)細(xì)胞M1型標(biāo)志物iNOS表達(dá)水平下降，小膠質(zhì)細(xì)胞M2型標(biāo)志物Arg-1表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖2A～C)。

A.iNOS and Arg-1 protein Western blot bands;B.iNOS protein quantification;C.Arg-1protein quantification；*P<0.05 compared with sham;#P<0.05 compared with the TBI+Null圖2 TREM2過(guò)表達(dá)改變TBI大鼠腦組織的小膠質(zhì)細(xì)胞表型Fig 2 TREM2 over-expression altered microglial phenotypes in brain tissues of TBI n=8)

2.4 TREM2過(guò)表達(dá)減弱了TBI大鼠的炎性反應(yīng)

與對(duì)照組相比，TBI組和TBI+Null組大鼠腦組織促炎性介質(zhì)(IL-1β，IL-6)表達(dá)水平升高，抗炎介質(zhì)(IL-4，IL-10)表達(dá)水平下降(P<0.05)；與(TBI+Null)組相比，(TBI+TREM2)組大鼠腦組織促炎性介質(zhì)(IL-1β，IL-6)表達(dá)水平下降，抗炎介質(zhì)(IL-4，IL-10)表達(dá)水平升高(P<0.05)(圖3A,B)。

A.quantification of IL-1β and IL-6mRNA expression;B.quantification of IL-4 and IL-10 mRNA expression;*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with the TBI+Null group圖3 大鼠腦組織神經(jīng)炎性反應(yīng)相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平Fig 3 mRNA expression levels of neuroinflammation-related factors in rat brain n=8)

2.5 TREM2過(guò)表達(dá)抑制了認(rèn)知障礙相關(guān)蛋白表達(dá)

與對(duì)照組相比，TBI組和(TBI+Null)組Aβ1-42、tau 蛋白水平明顯升高(P<0.05)；與(TBI+Null)組比，(TBI+TREM2)組Aβ1-42、tau 蛋白水平明顯下降(P<0.05)(圖4)。

A.Aβ1-42 and tau protein Western blot bands;B.Aβ1-42 protein quantification;C.tau protein quantification；*P<0.05 compared with sham;#P<0.05 compared with the TBI+Null圖4 大鼠腦組織認(rèn)知障礙相關(guān)蛋白表達(dá)水平Fig 4 Expression levels of cognitive impairment related proteins in rat brain n=8)

3 討論

本研究結(jié)果表明，TBI大鼠的腦組織中TREM2基因和蛋白質(zhì)水平較對(duì)照組上調(diào)，表明TREM2可能參與TBI的發(fā)病，TREM2的過(guò)表達(dá)可減少腦組織中認(rèn)知障礙相關(guān)蛋白(tau和Aβ1-42)表達(dá)，減輕大鼠認(rèn)知缺陷。TREM2還通過(guò)修飾小膠質(zhì)細(xì)胞表型來(lái)調(diào)節(jié)炎性因子的釋放，這也解釋了TREM2對(duì)TBI大鼠神經(jīng)炎性反應(yīng)的抑制及神經(jīng)功能的保護(hù)作用。

許多報(bào)道表明，神經(jīng)炎性反應(yīng)是包括TBI后認(rèn)知障礙在內(nèi)的多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制的主要誘因[8-9]。TBI后認(rèn)知障礙的神經(jīng)炎性反應(yīng)的特征是活化小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的炎性介質(zhì)水平升高[10]。新近有報(bào)道TREM2參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的炎性反應(yīng)機(jī)制，例如，脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)處理的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠的研究表明TLR4/TREM2可能是阿爾茨海默病(Alzheimer’s diseasem,AD)與全身炎性反應(yīng)之間的潛在聯(lián)系，還有研究表明TREM2通過(guò)減少神經(jīng)炎性反應(yīng)和多巴胺神經(jīng)元的凋亡對(duì)帕金森病具有神經(jīng)保護(hù)作用[11-12]?？傊琓REM2可能是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病中炎性反應(yīng)的上游調(diào)節(jié)劑。

神經(jīng)炎性反應(yīng)主要由小膠質(zhì)細(xì)胞驅(qū)動(dòng)，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的先天免疫細(xì)胞，在腦代謝和生理學(xué)等方面起核心作用[13]。活化的小膠質(zhì)細(xì)胞分為促炎性M1型和抗炎性M2型，它們一方面通過(guò)分泌促炎細(xì)胞因子引起神經(jīng)元損傷，另一方面通過(guò)釋放抗炎介質(zhì)而發(fā)揮有益作用。近年來(lái)TREM2與小膠質(zhì)細(xì)胞之間的關(guān)系備受關(guān)注，TREM2修飾了P301S tau轉(zhuǎn)基因小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞表型[14-15]。TREM2還可拮抗淀粉樣蛋白的病理改變和相關(guān)毒性，表明TREM2在體內(nèi)具有神經(jīng)保護(hù)作用，可作為一種治療AD的靶標(biāo)藥物來(lái)探索[16]。

總之，本研究表明TREM2的過(guò)表達(dá)通過(guò)調(diào)節(jié)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞表型和減少炎性反應(yīng)來(lái)減輕認(rèn)知缺陷。這些發(fā)現(xiàn)為T(mén)REM2在TBI后認(rèn)知障礙發(fā)病機(jī)制中的作用提供了新線索。