植物葉片排放甲烷的初步研究

蔡錫安，黃娟，吳彤，劉菊秀，蔣芬，王森浩

中國科學(xué)院華南植物園/中國科學(xué)院退化生態(tài)系統(tǒng)植被恢復(fù)與管理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510650

甲烷（CH4）是僅次于CO2的重要溫室氣體。過去普遍認(rèn)為，CH4的唯一生物產(chǎn)生過程是在厭氧條件下，有機(jī)物經(jīng)多種厭氧細(xì)菌作用生成小分子物質(zhì)（HCOOH、CH3COOH、CO2、H2等）后，再被產(chǎn)甲烷菌利用并生成 CH4（Peters et al.，1996；Segers，1998；鄧永翠等，2010）；因而堅(jiān)信：植物不能產(chǎn)生CH4，CH4的最大生物來源是濕地、稻田、垃圾填埋場以及反芻動物消化系統(tǒng)等。然而，自2006年Keppler等首次證實(shí)有氧條件下植物能夠釋放 CH4后，植物排放 CH4的相關(guān)報(bào)道也越來越多（Crutzen et al.，2006；Sanhueza et al.，2006；Cao et al.，2008；Wang et al.，2016）。熱帶地區(qū)是植物最大的CH4源，約占全球陸地排放2/3（Keppler et al.，2006；Keppler et al.，2008；Vigano et al.，2008；Wang et al.，2008）。還有研究表明，植物亦吸收CH4，如云杉（Picea abies）、樺木（Betula pubescens）、花楸（Sorbus aucuparia）和歐洲赤松（Pinus sylvestris）等，其平均吸收速率達(dá) 0.7 μmol·m?2·h?1（Sundqvist et al.，2012）；森林冠層是大氣CH4的重要的匯（Sundqvist et al.，2015）。另有一些植物則白天表現(xiàn)為源，晚上表現(xiàn)為匯（Zhang et al.，2014）。其他一些研究則顯示，不同種類、不同生長條件下的植物排放或吸收 CH4的通量有很大差異，據(jù)此推測植物CH4的排放或吸收可能與生長環(huán)境和植物種類等因素相關(guān)（Cao et al.，2008；Wang et al.，2008；Covey et al.，2019）。目前研究植物CH4排放對象多數(shù)集中在植物的枝條或樹干上（Jeffrey et al.，2019），對植物葉片CH4排放的研究少見報(bào)道。因此，在全球變暖的趨勢下，大范圍地開展熱帶陸地植物葉片實(shí)測研究，探討植物CH4的源或匯的功能及其對大氣CH4通量的貢獻(xiàn)具有重要的科學(xué)意義。

目前植物葉片排放CH4氣體樣品的采樣多數(shù)是借鑒其他氣體的采樣方法，如靜態(tài)箱法、動態(tài)枝條密閉法等。便攜式光合測定儀（如Li-6400等）具開放式氣路系統(tǒng)，其氣路具有精確的流量調(diào)控單元，通過適當(dāng)?shù)哪┒烁难b使其具備氣體采集功能，則可同時開展光合測定和CH4等氣體采集實(shí)驗(yàn)，為光合作用監(jiān)測和氣體的采集提供了更便捷的方案。為探討離體枝條葉片采樣排放氣體的可能性，利用Li-6400光合儀采集植物葉片排放氣體樣品時，分析離體枝條與原體枝條葉片排放 CH4氣體濃度的差異，驗(yàn)證離體枝條葉片CH4采樣的可行性。另在鼎湖山自然保護(hù)區(qū)的海拔梯度實(shí)驗(yàn)平臺，選擇木荷（Schima superba）、鼠刺（Itea chinensis）、紅車（Syzyglum hancei）和短序潤楠（Machilus breviflora）等4種植物為研究對象，測定由海拔梯度引起的溫度變化對其葉片釋放CH4的影響；還測定了其他10種低海拔常見植物葉片的CH4排放速率，為研究植物的CH4源或匯功能提供證據(jù)，也為今后CH4排放清單研究提供原始數(shù)據(jù)積累。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況和供試植物

試驗(yàn)地點(diǎn)位于廣東鼎湖山森林生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學(xué)觀測研究站（鼎湖山站）內(nèi)。鼎湖山站位于112°30′39″—112°33′41″E，23°09′21″—23°11′30″N，屬山地丘陵地貌，南亞熱帶季風(fēng)濕潤氣候。年均溫度為21.4 ℃，年平均降雨量為1927 mm。鼎湖山的土壤是由砂巖、砂頁巖發(fā)育而成的赤紅壤。本實(shí)驗(yàn)選擇本區(qū)低海拔常見植物 10種，分別為尾葉桉（Eucalyptusurophylla）、馬尾松（Pinus massoniana）、無憂樹（Saraca dives）、垂葉榕（Ficus benjamina）、大葉冬青（Ilex latifolia）、桂花（Osmanthus fragrans）、樹菠蘿（Artocarpus heterophyllus）、含笑（Michelia figo）、假檳榔（Archontophoenix alexandrae）、海南菜豆樹（Radermachera hainanensis）等。

另在鼎湖山自然保護(hù)區(qū)的海拔梯度實(shí)驗(yàn)平臺，選擇木荷（Schima superba）、鼠刺（Itea chinensis）、紅車（Syzyglum hancei）和短序潤楠（Machilus breviflora）等4種植物測定海拔對其釋放CH4的影響。本平臺建于2012年，根據(jù)海拔高度對氣溫等影響的原理而設(shè)置，具體是將海拔高度600 m的山地土壤移位到300 m和30 m區(qū)，并種植山地林的優(yōu)勢樹種開展實(shí)驗(yàn)，根據(jù)測定，30 m處理組比300 m處理組氣溫高約 1.5 ℃，比 600 m處理組高約3.0 ℃（劉菊秀等，2013）。

1.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)便攜式光合儀的設(shè)計(jì)原理，其開放氣式通路是通過氣閥和分流器使氣路中的 75%流量通過樣品室，然后排放到大氣中。通過對該儀器稍作改裝，只在樣品室氣路末端加裝三通閥，通過三通閥將氣體接入CH4采樣袋來收集CH4樣氣（如圖1）。本方法可收集葉片排放的氣體，且可調(diào)節(jié)氣體流速。

圖1 Li-6400光合儀采集植物葉片排放CH4的氣路示意圖Fig. 1 Passage of methane from plant leaf sampled by Li-6400 photosynthetic apparatus

實(shí)驗(yàn)于2018年9月—2019年9月進(jìn)行。因植物的光合能力在09:00—11:00最強(qiáng)，其氣孔活性也最大，因此，植物排放CH4的采樣工作也在該時段進(jìn)行。所有實(shí)驗(yàn)都選取植株冠層中上部向陽生長的枝條，在該枝條上選取健康、成熟的、距離頂端的第3、4葉片作為采樣對象。氣體采集的方法為光合儀的開路氣路連接氣袋方法收集（圖1）。除無憂樹和垂葉榕采用離體枝條采氣外，其余植物種類的氣體采集均采用原位法。

原位枝條葉片氣體采集：按上述選取植株和葉片的方法選擇葉片作為采樣對象。葉室為自然光透明葉室，按照光合作用測定的流程和要求，將葉片置于葉室內(nèi)，夾緊葉片，檢查葉室的密封性。讓葉片適應(yīng)1—2 min，然后從探頭的排氣端連接氣袋，打開閥門，進(jìn)行采樣。采樣時間為 1 min，流速為375 mL·min?1。每個樣品采集 3—5個重復(fù)樣。

離體枝條葉片氣體采集：原位氣體采集完成后，把采集的葉片作標(biāo)記，同時把葉片所在的枝條剪下（為了減少剪口傷害對葉片排放CH4的影響，剪口離葉片50 cm以上），立刻將剪口插入清水中，待水分平衡后，盡快以原位相同的方法完成標(biāo)記葉片（離體法和原體法為同一葉片）的氣體收集。離體枝條葉片的氣體收集一般在離體 2 h內(nèi)盡快完成（Wyka et al.，2012）。每個樣品采集3—5個重復(fù)樣。

在采集植物氣體樣品的同時，采集空氣樣品。采集樣品完成后，氣袋帶回實(shí)驗(yàn)室采用氣相色譜（Agilent 5890，Agilent Co. USA）連接火焰離子檢測器（FID）測定CH4氣體體積分?jǐn)?shù)。氣袋中的CH4通過2 m長、內(nèi)徑2 mm的60—80目13XMS色譜柱分離，分離條件為：柱溫 55 ℃，載氣為高純氮?dú)?，流量?30 mL·min?1。

CH4體積分?jǐn)?shù)計(jì)算公式：

式中：

?C——葉片釋放 CH4的凈體積分?jǐn)?shù)（μL·L?1）；

Cleaf——收集到的葉片排放的CH4體積分?jǐn)?shù)；

Cair——空氣中CH4體積分?jǐn)?shù)。當(dāng)?C為正值時，表明植物葉片釋放CH4；當(dāng)?C為負(fù)值時，表明植物葉片吸收CH4。

利用葉面積儀測定植物葉片樣品葉面積（m2），每片葉子測定3次，取均值。之后，將其置于烘箱中60 ℃下烘24 h至恒重，稱量其干質(zhì)量。計(jì)算采樣葉面積的干質(zhì)量（g），用于計(jì)算CH4的排放速率。

植物葉片CH4排放速率計(jì)算公式如下：

式中：

F——植物葉片的 CH4排放速率（μg·g?1·h?1）；

ρ——CH4氣體密度（μg·μL?1）；

V——流速（L·h?1）；

?C——葉片排放的CH4氣體與空氣CH4的體積分?jǐn)?shù)之差（μL·L?1）；

m——植物葉片采樣面積的干質(zhì)量（g）。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本研究中各指標(biāo)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差均應(yīng)用Excel 2013軟件計(jì)算。原位植物葉片采樣與離體枝條葉片采樣2種方法的差異性比較，通過SPSS 13.0軟件的配對樣本t檢驗(yàn)（Paired Sample Test）進(jìn)行分析，如果2種方法的P>0.05，即認(rèn)為2種采樣方法的結(jié)果沒有顯著差異。在海拔梯度實(shí)驗(yàn)中，采用雙因素方差分析法（two-way ANOVA）分析海拔與植物種類對甲烷排放的影響差異。應(yīng)用Origin 2019軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原位枝條和離體枝條葉片采樣CH4濃度比較

無憂樹和垂葉榕的葉片排放CH4的原位氣體采樣體積分?jǐn)?shù)分別為 (0.95±0.18)、(?0.39±0.11) μL·L?1；離體氣體采樣體積分?jǐn)?shù)分別為 (0.95±0.11)、(?0.51±0.06) μL·L?1（如圖2）；統(tǒng)計(jì)分析表明，這 2種采樣方法對無憂樹和垂葉榕排放CH4濃度均沒有顯著性影響（表1，P>0.05）。因此，在對高大喬木的葉片排放CH4氣體開展研究時，離體氣體采樣是可代替的方法。

圖2 原位與離體采樣的無憂樹、垂葉榕的CH4體積分?jǐn)?shù)Fig. 2 Volume fraction of CH4 from Saraca dives and Ficus benjamina in situ and in vitro methods

表1 原位采樣與離體采樣的配對樣本檢驗(yàn)Table 1 Paired sample test for methane concentration from in situ sampling and in vitro sampling

2.2 植物葉片的CH4排放情況

從表2可知，樹菠蘿和海南菜豆樹葉片CH4排放速率分別為 30.76—36.69、42.97—45.44 μg·g?1·h?1。垂葉榕則吸收 CH4，吸收速率為 39.85—120.36 μg·g?1·h?1；其他植物如大葉冬青、桂花、含笑、假檳榔、尾葉桉和馬尾松等，則均有排放和吸收現(xiàn)象，具體原因有待進(jìn)一步研究。

表2 植物葉片的CH4排放速率Table 2 Methane emission rate from plant leaves in southern China

2.3 海拔梯度對植物葉片排放CH4的影響

從圖3可知，海拔對4種植物（木荷、短序潤楠、紅車和鼠刺）葉片釋放CH4有較大影響。在海拔600 m處，木荷、短序潤楠、紅車和鼠刺植物排放 CH4體積分?jǐn)?shù)分別為 (0.09±0.00)、(0.06±0.00)、(0.07±0.04) 和 (0.01±0.00) μL·L?1。在 300 m 處，分別 為 (0.17±0.00)、 (0.28±0.06)、 (0.05±0.00) 和(0.11±0.05) μL·L?1?？梢娫诤０?600 m 和 300 m 處，4種植物葉片都排放CH4。在海拔30 m處4種植物排放CH4濃度有正亦有負(fù)，說明其葉片有排放和吸收CH4現(xiàn)象（表2，圖3）?？梢?，海拔的降低（增溫3.0 ℃）抑制了植物CH4的排放，并促進(jìn)了CH4的吸收，植物葉片從CH4源向匯轉(zhuǎn)變。

圖3 海拔梯度對植物葉片排放的CH4的影響Fig. 3 Responses of methane emission from tree leaves to different altitudes

統(tǒng)計(jì)分析表明，海拔梯度變化對樹種間的CH4釋放沒有顯著影響（P>0.05），但海拔梯度對同種葉片CH4的排放有顯著抑制作用（P<0.001），海拔與樹種對葉片CH4排放有交互作用（表3，P<0.01）。

表3 海拔梯度和樹種對葉片排放CH4影響的方差分析Table 3 Variance analysis of the effects on leaf methane emission from tree species and altitude

3 討論

對于高大的喬木來說，測定其冠層葉片的光合并不容易，因此，有些研究者采用離體的方法進(jìn)行測定（許大全，2002）。為了驗(yàn)證原位采樣和離體采樣對植物排放CH4的影響，開展了無憂樹和垂葉榕的葉片排放CH4的原位氣體采樣和離體氣體采樣的比較研究，結(jié)果表明，這2種采樣方法對無憂樹和垂葉榕排放的CH4濃度均沒有顯著性影響（表2，P>0.05）。結(jié)合LIi-6400光合測定儀等儀器，采用離體方法收集植物葉片排放CH4氣體具有操作方便、前期準(zhǔn)備時間短、樣品需求量小、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。因此，利用光合測定儀采集植物離體枝條葉片排放CH4的方法適合于野外采樣操作，可推廣應(yīng)用。

植物在有氧條件下能釋放CH4已被多個研究證實(shí)（Crutzen et al.，2006；Keppler et al.，2006；Sanhueza et al.，2006；Cao et al.，2008）。本研究結(jié)果也表明華南地區(qū)常見森林植物葉片能直接釋放CH4。陸地植物排放CH4與植物種類和環(huán)境因子（海拔梯度、溫度）密切相關(guān)（表2）。在海拔600 m和300 m環(huán)境中，植物顯著排放CH4，然而在海拔30 m的環(huán)境中，植物表現(xiàn)為排放或吸收CH4的現(xiàn)象（表2，圖3），即同一種植物在較低海拔處有時排放CH4，有時卻吸收CH4，其源或匯的角色并不固定。說明海拔梯度對植物排放或吸收CH4有明顯的影響，這可能與海拔梯度變化引起其他環(huán)境因子（溫度、濕度和 UVB輻射等）的變化有關(guān)，具體原因有待進(jìn)一步研究。

一般認(rèn)為，植物產(chǎn)生CH4是對環(huán)境脅迫的一種防御策略。增溫刺激植物釋放CH4，其機(jī)理是高溫促進(jìn)植物細(xì)胞壁組分果膠和多聚半乳糖醛等排放CH4（Keppler et al.，2006，2008）。果膠是植物排放CH4的前體物質(zhì)，Bruhn et al.（2009）檢測到高溫條件下（37 ℃和80 ℃）果膠的CH4排放。Vigano et al.（2008）則認(rèn)為，高溫會刺激植物材料或其組分（木質(zhì)素和纖維素等）甚至非結(jié)構(gòu)性組分（強(qiáng)氧化下的抗壞血酸）排放出大量的CH4。而本研究結(jié)果卻表明，在海拔降低導(dǎo)致的自然增溫（≤3.0 ℃）環(huán)境中，植物并不會增加葉片的CH4釋放，相反，植物出現(xiàn)了CH4吸收現(xiàn)象。推測原因可能是，小幅度內(nèi)的自然增溫（自然增溫≤3.0 ℃）并不會對植物的生長造成脅迫，因而不會增加葉片的CH4釋放；相反，自然增溫反而導(dǎo)致了葉片吸收CH4現(xiàn)象，詳細(xì)的機(jī)理還需更進(jìn)一步的探索。這個結(jié)果暗示，在未來的全球變暖情況下，植物可能是大氣CH4的潛在匯，這對評估森林的碳匯功能和溫室氣體減排具有重要的意義。

4 結(jié)論

原位和離體采集植物葉片排放的CH4氣體濃度沒有顯著性差異。利用光合測定儀采集植物離體枝條葉片排放CH4的采樣方法適合于野外采樣操作，可推廣應(yīng)用。

在華南地區(qū)低海拔的14種植物中，無憂樹、樹菠蘿和海南菜豆樹具有明顯的CH4排放，而垂葉榕則表現(xiàn)為明顯的CH4吸收，其他植物（尾葉桉、馬尾松、大葉冬青、假檳榔、含笑、桂花等）表現(xiàn)為有時吸收、有時排放CH4的現(xiàn)象。研究結(jié)果初步證明植物在有氧的環(huán)境中可直接排放或吸收CH4。

海拔梯度對植物的甲烷源或匯功能有重要影響。在南亞熱帶地區(qū)較小幅度內(nèi)的海拔降低（自然增溫≤3.0 ℃），可導(dǎo)致植物葉片由CH4釋放轉(zhuǎn)變?yōu)镃H4吸收。在今后的植物CH4排放清單中，應(yīng)考慮植物種類及環(huán)境因子對植物CH4源匯功能的影響，以準(zhǔn)確評估其對碳中和的生態(tài)貢獻(xiàn)。