ICAM-1、MMP-9 及NF-κB 在膽管癌中的表達(dá)及與外周血免疫抑制細(xì)胞的關(guān)系

李志強(qiáng)，高紅強(qiáng)，李鏡鋒，余杰琦，王冬冬，陳 剛，褚 光

（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院肝膽胰外科，云南 昆明 650224）

肝內(nèi)膽管癌是一種來(lái)源于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，具有高度惡性、高病死率、低診斷率特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅患者生命健康[1?2]。我國(guó)膽管癌發(fā)病率為0.01%～0.46%，且調(diào)查顯示其占惡性腫瘤總數(shù)的2%，好發(fā)于中老年人。由于膽管癌早期容易侵襲周圍組織器官以及出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是預(yù)后差、手術(shù)切除率低的根本原因，目前診斷和治療水平尚無(wú)取得突破性進(jìn)展，且具體病機(jī)制尚未完全明確，而從腫瘤生物學(xué)角度尋求更好的預(yù)防以及治療方法是研究熱點(diǎn)[3?4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）及NF-κB 與惡性腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[5?6]。髓源性抑制細(xì)胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的具有免疫調(diào)節(jié)功能的一類免疫細(xì)胞亞群，在自身免疫、炎癥及腫瘤中發(fā)揮重要作用。本文研究旨在探討ICAM-1、MMP-9 及NF-κB 在膽管癌中的表達(dá)及與外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院于2017 年12 月至2019 年12 月收治的膽管癌患者60 例研究對(duì)象，均行根治性手術(shù)治療，且均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)，患者均未采取抗腫瘤治療，及3 個(gè)月未使用免疫抑制劑。60 例患者中，男性38 例，女性22 例；年齡36～78 歲，平均（58.39±10.21）歲；臨床分期：I～I(xiàn)I 期19 例，III～I(xiàn)V 期41 例；病理分級(jí)：低分化34 例，中高分化26 例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移21 例。經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)附屬甘美醫(yī)院倫理委員會(huì)審查同意開(kāi)展研究。

診斷標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)《膽管癌診斷與治療--外科專家共識(shí)》[7]關(guān)于肝內(nèi)膽管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，臨床表現(xiàn)出現(xiàn)腹部不適、腹痛、上腹腫塊、乏力、惡心、發(fā)熱等，經(jīng)超聲檢查證實(shí)肝內(nèi)局限性腫塊。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合肝內(nèi)膽管癌診斷標(biāo)準(zhǔn)，均行根治性手術(shù)治療，且經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為肝內(nèi)膽管癌；（2）均未采取抗腫瘤治療；（3）3 個(gè)月未使用免疫抑制劑。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）其他類型膽管癌及合并其他惡性腫瘤者；（2）臨床資料和隨訪資料不完整。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：鼠抗人ICAM-1 抗體，兔抗MMP-9 單克隆抗體，兔抗NF-κB 單克隆抗體，均購(gòu)自武漢博士德生物試劑公司。主要儀器：美國(guó)BD 公司流式細(xì)胞儀。

1.3 方法

（1）免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白：取患者癌組織和癌旁正常組織標(biāo)本，經(jīng)10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，4 μm 厚連續(xù)切片，按照免疫組化SP 法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，檢測(cè)ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白，以PBS 代替一抗作為陰性對(duì)照，試劑公司提供的陽(yáng)性著色圖片為陽(yáng)性對(duì)照。于光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果，著色的結(jié)果判定采用半定量法，首先以細(xì)胞著色強(qiáng)弱度評(píng)分[1]：以無(wú)著色者為計(jì)分0 分，以淺黃色者為計(jì)分1 分，以棕黃色者計(jì)分為2 分，以棕褐色者計(jì)分為3 分。且記錄鏡下陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)所占的百分比：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞者為計(jì)分0 分，陽(yáng)性細(xì)胞≤10%者為計(jì)分1 分，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)為計(jì)分11%～50%者為計(jì)分2 分，在51%～75%者為計(jì)分4 分。再按照上述兩者所得評(píng)分相乘結(jié)果劃分等級(jí)：其中以積分≤3 分即為“-”，以積分3～5 分為“+”，以積分5～8 分為“++”，以積分9～12 分則為“+++”[1]。

（2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例：所有研究對(duì)象均于入院第2 d 清晨空腹采集患者3 mL 外周靜脈血，以肝素抗凝，取抗凝全血100 μL，以紅細(xì)胞裂解液充分裂解后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)量取不同熒光標(biāo)記抗體直接標(biāo)記，對(duì)外周血 CD14、CD11b 和HLADR 抗原表達(dá)檢測(cè)，且標(biāo)記同型對(duì)照，放置于4 ℃下避光孵育30 min，采用流式緩沖液洗滌2 次后上機(jī)檢測(cè)。圈取CD14+CD11b+的細(xì)胞群，再選擇HLA-DR-細(xì)胞群即為MDSC。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）觀察膽管癌組織與癌旁組織ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB 蛋白表達(dá)；（2）觀察不同病理特征ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB蛋白表達(dá)；（3）觀察不同病理特征外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比 例；（4）分 析ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB 蛋白表達(dá)與外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例相關(guān)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 22.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，以率表示，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Pearson 相關(guān)性分析 ICAM-1 蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB 蛋白表達(dá)與CD14+CD11b+HALDR-MDSC 比例相關(guān)性。以P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膽管癌組織與癌旁正常組織ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB 蛋白表達(dá)比較

膽管癌組織ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均高于癌旁正常組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1 和圖1～圖3。

表1 膽管癌組織與癌旁正常組織ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB 蛋白表達(dá)比較[n（%）]Tab.1 Comparison of ICAM-1 protein,MMP-9 protein and NF-κ B protein expression between cholangiocarcinoma and adjacent normal tissues [n（%）]

圖1 ICAM-1 蛋白表達(dá)（HE，×200）Fig.1 ICAM-1 protein expression（HE，×200）

圖2 MMP-9 蛋白表達(dá)（HE，×200）Fig.2 MMP-9 protein expression（HE，×200）

圖3 NF-κB 蛋白表達(dá)（HE，×200）Fig.3 NF-κB protein expression（HE，×200）

2.2 不同病理特征ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白、NF-κB 蛋白以及CD14+CD11b+HAL-DRMDSC 表達(dá)比較

不同性別、年齡、病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移ICAM-1 蛋白表達(dá)比較無(wú)明顯差異（P>0.05）；III～I(xiàn)V 期ICAM-1 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于I～I(xiàn)I 期（P<0.05）。不同性別、年齡、病理分級(jí)和臨床分期MMP-9 蛋白表達(dá)比較無(wú)明顯差異（P>0.05）；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移MMP-9 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P<0.05）。不同性別、年齡、病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移NF-κB 蛋白表達(dá)比較無(wú)明顯差異（P>0.05）；III～I(xiàn)V 期NF-κB 蛋白表達(dá)陽(yáng)性率高于I～I(xiàn)I 期（P<0.05）。不同性別、年齡、病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例比較無(wú)明顯差異（P>0.05）；III～I(xiàn)V 期CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例高于I～I(xiàn)I 期（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 不同病理特征ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白、NF-κB 蛋白以及CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 表達(dá)比較[n（%）]Tab.2 Comparison of ICAM-1 protein MMP-9 protein NF-κB protein and NF-κB protein expression in different pathological features [n（%）]

2.3 ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白表達(dá)與CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例相關(guān)性

ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋 白表達(dá)與CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例呈線性正相關(guān)，見(jiàn)表3。

表3 ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白表達(dá)與CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例相關(guān)性Tab.3 Expression of ICAM-1 protein,MMP-9 protein and NF- κB protein and its correlation with the proportion of CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC

3 討論

膽管癌是常見(jiàn)的一種膽道惡性腫瘤，通常情況下其癥狀出現(xiàn)晚，且具有較高發(fā)病率和病死率，嚴(yán)重威脅患者生命健康[7?9]。因此，采取及時(shí)有效的診斷和治療膽管癌方法尤為重要。

ICAM-1 人體正常組織中表達(dá)極低，僅某些淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞少量表達(dá)。ICAM-1 主要通過(guò)街道腫瘤細(xì)胞與白細(xì)胞黏附，導(dǎo)致原發(fā)腫瘤分離和壞死，增加轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)；血循環(huán)中瘤細(xì)胞/白細(xì)胞結(jié)合體，容易在毛細(xì)血管床滯留著床[10]。通常情況下，高表達(dá)ICAM-1 瘤細(xì)胞經(jīng)人淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原（LFA-1）結(jié)合，從而抑制免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺滅和識(shí)別[11]。此外，ICAM-1 參與腫瘤與基質(zhì)的粘附，以及促進(jìn)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，并且與膽管癌預(yù)后關(guān)系緊密[12]。本文研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者膽管癌組織中ICAM-1 高表達(dá)，且于臨床分期密切相關(guān)?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）是形成和影響腫瘤微環(huán)境的一種蛋白水解酶家族，其中MMP-9 是MMPs 中分子量最大成員。MMP-9 最初主要以酶原形式分泌而產(chǎn)生，而其被激活后形成IV 型膠原酶，使腫瘤表面細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜降解、破壞，且可使IV、V、VII 和X 型膠原降解，以及使腫瘤細(xì)胞沿缺失的基膜浸潤(rùn)周圍，而造成腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，進(jìn)而促進(jìn)演變惡性腫瘤[13?15]。研究報(bào)道顯示，MMP-9 的陽(yáng)性表達(dá)與膽管癌組織分化程度、臨床分期和轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)呈正相關(guān)[16]。而本文研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者膽管癌組織中MMP-9 高表達(dá)，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與上述研究存在一些差異，其原因可能是由于本文樣本量相對(duì)較少，還需后續(xù)增加樣本量進(jìn)一步研究。NF-κB 是細(xì)胞內(nèi)重要的一種轉(zhuǎn)錄因子，通常于靜息狀態(tài)下以異源或同源二聚體形式與抑制蛋白結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)細(xì)胞受外源性刺激，抑制蛋白與NF-κB 剝離，進(jìn)入細(xì)胞核，從而發(fā)揮其調(diào)控作用[17]。研究報(bào)道顯示，NF-κB 是腫瘤與連續(xù)持續(xù)炎癥的重要中介因子[18]。此外，研究報(bào)道顯示，NF-κB 在膽管癌組織中呈過(guò)表達(dá)，以及其在腫瘤組中表達(dá)水平高于正常組與膽管結(jié)石炎癥組[19]。本文研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者膽管癌組織NF-κB 高表達(dá)，且與臨床分期密切相關(guān)。MDSC 是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的具有免疫調(diào)節(jié)功能一種免疫細(xì)胞亞群，能夠通過(guò)多種途徑抑制機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)、且在移植免疫、炎癥、腫瘤及自身免疫中發(fā)揮重要作用。同時(shí)，MDSC 限制腫瘤免疫治療的效果，且參與腫瘤的免疫逃逸。研究報(bào)道顯示，腫瘤患者外周血中免疫抑制細(xì)胞的比例增加，且可促進(jìn)腫瘤的免疫逃逸[20]。本文研究發(fā)現(xiàn)，膽管癌患者中外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例升高，且與臨床分期密切相關(guān)。

綜上所述，ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白表在膽管癌中高表達(dá)，外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例升高，且ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白表達(dá)與CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例呈線性正相關(guān)。