降鈣素受體、維生素D 受體基因多態(tài)性與昆明地區(qū)2 型糖尿病合并骨質(zhì)疏松的關(guān)系

牛 玲 ，李博一 ，張 程 ，馬 蓉 ，唐 艷 ，劉 方 ，尹利民 ，韓竺君 ，苗翠娟 ，張 嫻

（1）昆明市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科；2）檢驗(yàn)科，云南 昆明 650011）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者易同時(shí)合并骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）。由于骨質(zhì)疏松導(dǎo)致的骨折和骨折致殘嚴(yán)重影響患者生活，同時(shí)給家庭、社會(huì)帶來(lái)沉重經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此重視防治糖尿病性骨質(zhì)疏松對(duì)于糖尿病患者的生活質(zhì)量改善具有重要意義。遺傳是T2DM 和OP 重要的發(fā)病因素，有研究認(rèn)為糖尿病性骨質(zhì)疏松是一種多基因遺傳病，這些基因[1]包括降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）基因、維生素D 受體（vitamin dreceptor，VDR）基因及護(hù)骨素基因等.對(duì)糖尿病性骨質(zhì)疏松的單一基因研究較多，但不同基因間的聯(lián)合研究較少，而且結(jié)論不一。本研究旨在探討CTR 聯(lián)合VDR 基因多態(tài)性與昆明地區(qū)T2DM 伴骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系，以期為昆明地區(qū)T2DM 伴骨質(zhì)疏松癥的防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

隨機(jī)抽樣選取2017 年6 月至2019 年1 月在昆明市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科住院治療的2 型糖尿病患者237 例，其中男性122 例，女性115 例，年齡50～84 歲，平均（64.68±7.92）歲。2 型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2013 年版《中國(guó)2 型糖尿病防治指南》標(biāo)準(zhǔn)診斷糖尿病[2]。骨質(zhì)疏松癥診斷標(biāo)準(zhǔn)采用2011 年版《原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥診治指南》標(biāo)準(zhǔn)診斷[3]，按T 值評(píng)分診斷骨質(zhì)疏松。所有入選的2 型糖尿病患者在昆明地區(qū)居住時(shí)間均大于10 a。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）1 型糖尿病，繼發(fā)性糖尿??；（2）各種糖尿病急性并發(fā)癥、伴有感染、營(yíng)養(yǎng)不良、嚴(yán)重心腦及肝腎疾病、腫瘤患者；（3）皮膚疾病無(wú)法接受陽(yáng)光照射者；（4）甲狀腺手術(shù)史，合并其他可能引起甲狀腺激素代謝異常的其他內(nèi)分泌、免疫系統(tǒng)疾病、結(jié)締組織病者，如垂體瘤、垂體功能減退者，亞急性甲狀腺炎等；（5）存在類風(fēng)濕或風(fēng)濕或關(guān)節(jié)炎，且應(yīng)用激素類藥物時(shí)間超過(guò)6 個(gè)月，或曾經(jīng)接受活性維生素D、降鈣素、雌激素受體調(diào)節(jié)劑等影響骨代謝的藥物治療者；（6）存在畸形性骨關(guān)節(jié)炎者和成骨不全患者。納入的研究對(duì)象均簽署知情同意書，且本研究經(jīng)昆明市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 分組

（1）將237 例患者按骨密度檢測(cè)結(jié)果分為糖尿病無(wú)骨質(zhì)疏松癥61 例；糖尿病合并骨量減少111 例；糖尿病伴骨質(zhì)疏松65 例。

（2）將237 例患者按CTR 及VDR 基因型進(jìn)行組合，共有6 種類型，分別為CCBB 型28 例，CCBb 型142 例，CCbb 型11 例，CTBB 型3 例，CTBb 型42 例，CTbb 型11 例，隨后經(jīng)卡方檢驗(yàn)，據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行合并，最后分為三種組合型：CC+BB 型28 例，CC+Bb、bb 型153 例，CT+BB、Bb、bb 型56 例。

1.3 研究方法

1.3.1 一般指標(biāo)記錄年齡、性別、糖尿病病程，男性是否吸煙，男性是否飲酒。測(cè)試當(dāng)日由專人用固定體重/身高測(cè)量?jī)x測(cè)定：體重、身高、計(jì)算體重指數(shù)（BMI），單位kg/m2。

1.3.2 血壓指標(biāo)采用汞柱式標(biāo)準(zhǔn)袖帶血壓表，受試者入院時(shí)休息5 min 后測(cè)定坐位右上臂收縮壓（SBP）/舒張壓（DBP），單位mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。

1.3.3 其他生化指標(biāo)受試者隔夜禁食8～12 h，入院第二天清晨6 點(diǎn)30 分-8 點(diǎn)取靜脈血測(cè)空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、肝腎功能電解質(zhì)（血鈣）、血脂、尿酸（UA）、維生素D 濃度、雌激素水平、睪酮水平，超敏C 反應(yīng)蛋白（Hs-CRP）、纖維蛋白原（FIB）。按標(biāo)準(zhǔn)方法行OGTT試驗(yàn)，檢測(cè)OGTT-0h、2 h 血糖，采用化學(xué)發(fā)光法測(cè)定0 h、2 h 胰島素（INS）水平（單位：mIU/L）。再采用穩(wěn)態(tài)模型評(píng)估胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）：HOMA-IR=FINS X FPG/22.5，F(xiàn)INS 單位為mIU/L，F(xiàn)PG 即OGTT-0 h，單位為mmol/L。低的HOMAIR 示高胰島素敏感性，而高的HOMA-IR 表示胰島素敏感性差，存在胰島素抵抗。

1.3.4 外周血基因組DNA 提取空腹采集靜脈血6～8 mL，EDTA 抗凝，-80 ℃保存，標(biāo)本收集結(jié)束后購(gòu)進(jìn)DNA 提取試劑盒統(tǒng)一提取CTR、VDR 基因。所需試劑及儀器為：DNA 提取試劑盒，購(gòu)于AXYGEN 公司；DNA 聚合酶（2×Taq Master Mix）購(gòu)于Bioteke 公司，引物由昆明碩擎公司合成；普通PCR 儀購(gòu)于美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（型號(hào)ABI2720）；各種規(guī)格的離心管、槍尖、PCR 管、一次性乳膠手套和口罩購(gòu)于NSET 公司。

1.3.5 PCR 擴(kuò)增（1）PCR 基因擴(kuò)增所使用的引物，見(jiàn)表1；（2）PCR 反應(yīng)體系：25 μL 混勻液體。包括2XTaq PCR Master Mix 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μM，碩擎）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μM，碩 擎）1 μL，Template DNA 4 μL，Nuclease-freeWater 8.5 μL；（3）PCR 反應(yīng)條件：共35 個(gè)循環(huán)，95 ℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，反應(yīng)完成后，72 ℃再延伸10 min；（4）酶切鑒定基因型：CTR 基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用AluⅠ內(nèi)切酶酶切后，VDR 基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用BsmⅠ酶酶切后，置于2%瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。

表1 PCR 擴(kuò)增所使用的引物Tab.1 The primer PCR amplification

1.3.6 骨密度測(cè)量采用通用電氣醫(yī)療系統(tǒng)（中國(guó)）有限公司生產(chǎn)的雙能X 線骨密度儀（型號(hào)DPX Bravo）測(cè)量腰椎L1-L4、股骨頸、髖部骨密度及T 值評(píng)分（BMD），單位g/cm2。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS11.5 軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。采用Hardy-Weinberg 平衡檢測(cè)基因型的分布是否具有代表性。正態(tài)分布計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，3 個(gè)獨(dú)立樣本比較，采用方差分析，組間比較用最小有意義差異法（LSD 檢驗(yàn)）。非正態(tài)分布計(jì)量資料用M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用多因素Logistic 回歸分析篩選獨(dú)立危險(xiǎn)因素，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組人群一般資料比較

3 組人群一般資料總體比較，結(jié)果顯示：性別、年齡、吸煙、飲酒、DBP、身高、體重、BMI、HDL-C、雌激素、睪酮差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。且在兩兩比較時(shí)，T2DM 伴骨質(zhì)疏松組與無(wú)骨質(zhì)疏松組比較，上述指標(biāo)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.017），見(jiàn)表2。

表2 研究對(duì)象的一般資料比較 [/M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of general data of study objects [/M（P25，P75）]

表2 研究對(duì)象的一般資料比較 [/M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of general data of study objects [/M（P25，P75）]

*P <0.05。

2.2 CTR 及VDR 基因型

2.2.1 CTR 基因型酶切電泳圖結(jié)果顯示：CTR基因AluI 酶切位點(diǎn)多態(tài)性確定為：純合子CC 型228 bp 一條帶 ；雜合子CT 型228 bp 和120 bp兩條帶；純合子 TT 型120 bp 一條帶，見(jiàn)圖1。

圖1 CTR 基因型酶切電泳圖Fig.1 CTR genotypes enzyme electrophoresis figure

2.2.2 VDR 基因型酶切電泳圖結(jié)果顯示：VDR基因Bsm I 酶切位點(diǎn)多態(tài)性確定為:純合子BB 型825 bp 一條帶 ；雜合子Bb 型825 bp、675 bp、150 bp 三條帶；純合子bb 型675 bp、150 bp 兩條帶，見(jiàn)圖2。

圖2 VDR 基因型酶切電泳圖Fig.2 VDR genotypes enzyme electrophoresis figure

2.2.3 CTR 聯(lián)合VDR 基因型分布情況CTR、VDR 基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律，說(shuō)明所選人群代表性好。在237 例人群中，CTR聯(lián)合VDR 基因型分布情況為：以CCBb 型為主（142 例、占60.0%），其次為CCBB 型28 例（11.8%），CCbb 型11 例（4.6%），CTBB 型3 例（1.3%），CTBb 型42 例（17.7%），CTbb 型11 例（4.6%）。隨后按2 型糖尿病無(wú)骨質(zhì)疏松癥組，合并骨量減少組，骨質(zhì)疏松組分3 組，6 個(gè)基因組合經(jīng)卡方檢驗(yàn)，據(jù)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行合并，最后分為三種組合型：CC+BB 型28 例，CC+Bb、bb 型153 例，CT+BB、Bb、bb 型56 例。

2.2.4 3 組人群CTR 聯(lián)合VDR 基因型組合比較結(jié)果顯示：3 組人群VDR 聯(lián)合CTR 基因型組合CCBB 型，CC+Bb、bb 型，CT+BB、Bb、bb 型比較，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=1.604，P=0.808），見(jiàn)表3。

表3 CTR 聯(lián)合VDR 基因型分布頻率比較[n（%）]Tab.3 CTR system joint VDR genotypes distribution frequency comparison [n（%）]

2.3 CTR 聯(lián)合VDR 基因型組合與2 型糖尿病患者BMD 的關(guān)系

結(jié)果顯示：237 例T2DM 患者中，VDR 聯(lián)合CTR 的不同基因型組合在各部位的BMD 值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表4。

表4 VDR 聯(lián)合CTR 基因多態(tài)性與2 型糖尿病患者BMD 的關(guān)系（g/cm2）（）Tab.4 The relationship between the CTR system joint VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients（g/cm2）（）

表4 VDR 聯(lián)合CTR 基因多態(tài)性與2 型糖尿病患者BMD 的關(guān)系（g/cm2）（）Tab.4 The relationship between the CTR system joint VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients（g/cm2）（）

2.4 多因素Logistic 回歸分析結(jié)果

將VDR 及CTR 基因型組合（1 為CCBB 型，2 為CC+Bb、bb 型，3 為CT+BB、Bb、bb 型）及單因素分析3 組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的變量，即性別（0 為女，1 為男）、年齡、吸煙（0 為無(wú)，1 為有）、飲酒（0 為無(wú)，1 為有）、DBP、身高、體重、BMI、HDL-C、雌激素、睪酮作為自變量，糖尿病有無(wú)骨質(zhì)疏松作為因變量（0 為無(wú)，1 為有），進(jìn)行多因素Logistic 回歸分析，以篩選糖尿病伴骨質(zhì)疏松的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)果顯示：僅年齡（OR1.089、98%CI：1.033～1.148、P=0.002）、可以進(jìn)入回歸方程，見(jiàn)表5。

表5 Logistic 回歸分析結(jié)果Tab.5 Logistic analysis results

3 討論

國(guó)內(nèi)有報(bào)道[4]，近1/3 的糖尿病患者同時(shí)合并骨質(zhì)疏松癥。然而，T2DM 伴骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，糖尿病高血糖狀態(tài)、糖基化終末產(chǎn)物（AGEs）、糖尿病慢性并發(fā)癥、氧化應(yīng)激損傷、炎癥因子（CRP、IL-6 等）水平的升高、胰島素及胰島素樣生長(zhǎng)因子分泌的減少等均可能影響骨代謝[5?7]。另外，年齡、性別、生活方式、體重、吸煙、營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)、環(huán)境和遺傳等均是重要的影響因素。目前，對(duì)于單個(gè)基因與2 型糖尿病伴骨質(zhì)疏松癥的研究，國(guó)內(nèi)外已有不少報(bào)道，但CTR 聯(lián)合VDR 基因多態(tài)性與2 型糖尿病伴骨質(zhì)疏松癥的研究報(bào)道較少。

降鈣素（ealeitonin，CT）是甲狀腺濾泡旁細(xì)胞分泌的多肽激素[8]，它能增強(qiáng)腎臟排泄鈣的能力，抑制破骨細(xì)胞的骨再吸收作用[9]。CTR 位于破骨細(xì)胞膜，分子量為89 kD，包含490 個(gè)氨基酸，現(xiàn)已證明氨基端功能區(qū)的e2 區(qū)是降鈣素結(jié)合位點(diǎn)。CTR 基因位于染色體7q21.3 上，CTR 基因的多態(tài)性是其核苷酸序列1377 處的C 突變?yōu)門，導(dǎo)致相應(yīng)的蛋白結(jié)構(gòu)中第463 氨基酸脯氨酸（CCG）突變?yōu)榱涟彼幔–TG），從而使CTR 基因產(chǎn)生CC（純脯氨酸）、TT（純亮氨酸）、TC（脯氨酸、亮氨酸雜交型）3 種基因型[10]。

維生素D 是一組脂溶性類固醇衍生物，可以調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、促進(jìn)胰島素合成及分泌、增加胰島素敏感性。微生素D 在人體內(nèi)沒(méi)有生物活性，臨床上往往通過(guò)檢測(cè)循環(huán)中的25（OH）D3 來(lái)反映人體內(nèi)維生素D 的水平。VDR 屬類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族，廣泛存在于30 多種組織中[11]。維生素D 受體基因位于12 號(hào)染色體長(zhǎng)臂q12-14，長(zhǎng)約75 kD，是甾體類受體家族中的一員，由9 個(gè)外顯子和8 個(gè)內(nèi)含子組成。對(duì)于VDR基因多態(tài)性，目前主要研究包括Fok I（rs2228570）、Bsm I（rsl544410）、Apa I（rs7975232）、Taq I（rs731236）4 種，F(xiàn)ok I 位于編碼區(qū)，控制VDR 蛋白生成；Bsm I、Apa I、Taq I 位于基因3′端，可能與多聚腺苷酸復(fù)制及VDR mRNA 穩(wěn)定性有關(guān)。本研究選取Bsm I 酶切位點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示：從無(wú)骨質(zhì)疏松癥組-骨量減少組-骨質(zhì)疏松癥組，身高、體重、BMI 逐漸下降；女性占比則增多，分別是15 例（24.6%），50 例（45%），50 例（76.9%）；男性吸煙占比也增大，分別是24 例（52.2%），32 例（52.5%），11 例（73.3%）；提示體重可能是2 型糖尿病患者骨質(zhì)疏松的保護(hù)性因素，而女性2 型糖尿病患者更易患骨質(zhì)疏松，吸煙可能是2 型糖尿病患者骨質(zhì)疏松的危險(xiǎn)因素。但進(jìn)一步Logstic 回歸分析顯示：身高、體重、BMI、性別、吸煙均未進(jìn)入回歸方程，尚不能說(shuō)明體重、性別、吸煙是昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松的癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

從無(wú)骨質(zhì)疏松組-骨量減少組-骨質(zhì)疏松癥組，年齡逐漸增加，進(jìn)一步Logstic 回歸分析顯示：年齡可進(jìn)入回歸方程，說(shuō)明年齡是昆明地區(qū)T2DM伴骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。與國(guó)內(nèi)曹國(guó)磊[12]的研究結(jié)果一致。隨年齡增長(zhǎng)，人體骨量在變化，30～40 歲時(shí)骨量積累達(dá)峰值，以后逐漸下降。Jonsson 等[13]發(fā)現(xiàn)：70 歲女性髖部骨折幾率是女輕女性的5 倍。所以，應(yīng)做好70 歲以上老年人骨質(zhì)疏松的防治工作。

在2 型糖尿病患者中，無(wú)骨質(zhì)疏松組，骨量減少組，骨質(zhì)疏松組3 組比較，CTR-VDR 基因型組合后分布頻率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。進(jìn)一步按CTRVDR 分組發(fā)現(xiàn)：三種組合的基因型患者，不同部位骨密度比較也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。孟德峰[14]對(duì)新疆漢族女性的研究也發(fā)現(xiàn)：在骨質(zhì)疏松組患者中，CTR-VDR 復(fù)合基因型與各部位骨密度無(wú)關(guān)。

綜上所述，T2DM 伴骨質(zhì)疏松癥的影響因素及候選基因較多，筆者的研究發(fā)現(xiàn)，年齡是T2DM 伴骨質(zhì)疏松癥的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但未發(fā)現(xiàn)CTR-VDR 復(fù)合基因型與昆明地區(qū) T2DM 伴骨質(zhì)疏松癥的遺傳易感性有關(guān)。有待進(jìn)行更加深入、廣泛、大樣本、多地域、多種族、多個(gè)基因的聯(lián)合研究，以期為2 型糖尿病骨質(zhì)疏松的防治工作提供更多的有用信息和依據(jù)。