基因編輯技術及其在桑樹育種中的應用前景展望

黃 錦，李 勇，于 翠，朱志賢，莫榮利，董朝霞，胡興明，鄧 文

（湖北省農業(yè)科學院經濟作物研究所，武漢 430064）

桑樹（Morus albaL.）是中國最常見的園藝植物之一，廣泛分布于中國的各?。ㄊ?、自治區(qū)）［1］。桑樹是家蠶的惟一食用植物，中國自古以來就用桑葉喂蠶。蠶桑產業(yè)至今仍是中國的優(yōu)勢產業(yè)，因其具有較高的經濟回報和較大的就業(yè)潛力，在中國經濟和社會發(fā)展中有著重要地位［2］。桑樹是多用途的經濟樹種，在食用、藥用和生態(tài)修復等方面具有較高的價值［3］。隨著桑樹的多種功能被重視，適用于不同用途的桑樹育種迎來了前所未有的挑戰(zhàn)，與傳統(tǒng)的木本植物育種一樣，由于高雜合度和長世代周期，桑樹育種極為緩慢和困難［4］。伴隨著生物技術、分子生物學和生物信息學的快速發(fā)展，分子育種、轉基因、基因編輯技術等一大批新技術被應用到植物育種工作中，極大地提高了植物育種的效率。目前，傳統(tǒng)育種方法和新型育種手段相結合培育優(yōu)良植物品種已成為趨勢［5］。其中，近年來不斷發(fā)展的基因編輯技術被人們廣泛關注，尤其是CRISPR/Cas9 基因編輯技術［6］，它不僅能夠對目標基因進行精準修飾，而且具有成本低廉、操作簡單、編輯效率高等優(yōu)點，已被大量應用于植物基因組功能和遺傳改良等相關研究。本文主要綜述基因編輯技術的類型、作用機制及CRISPR/Cas9 基因編輯技術在植物領域中的應用，并對CRISPR/Cas9 基因編輯技術在桑樹育種中的應用前景進行展望，以期為桑樹多元化種質創(chuàng)新提供借鑒和思路。

1 基因編輯的類型與作用機制

基因編輯技術是指在基因組水平上對靶基因位點進行精確定向修飾的新技術［6］。基因編輯技術根據(jù)其所用的特異性核酸酶的不同可分為3 類：鋅指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）［7］、類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALEN）［8］和規(guī)律間隔成簇短回文重復序列（CRISPR/Cas）系統(tǒng)［9］。這些技術都是通過特異性識別目標基因的特定DNA 序列，利用特異性核酸酶（SSN）在靶位點產生DNA 雙鏈斷裂（DSB）。植物的內源性修復系統(tǒng)可以通過非同源端連接（NHEJ）和同源重組（HR）2 種方式來修復DSB，最終導致基因的敲除、替換和插入［10］。3 種基因編輯技術識別目的DNA的原理也有所不同，其中ZFN 和TALEN 利用蛋白質識別目的DNA，而CRISPR/Cas利用RNA 識別目的DNA［11］。

1.1 ZFN

ZFN 是一種序列特異性核酸酶，由人工設計的鋅指DNA 特異性結合區(qū)域與限制性內切酶FokI的DNA 非特異性切割域融合而成［12］。每個鋅指單元識別3 個堿基對（bp）的目標序列，通常多個鋅指單元組合成一組，與特定的DNA 序列結合［13］。由于FokI 是以二聚體的狀態(tài)發(fā)揮其核酸內切酶的切割功能，典型的ZFN 被設計為2 個正反向排列的ZFN單體，結合在18-bp 或24-bp 序列上且兩單體間隔5～7 個核苷酸，F(xiàn)okI 結構域在2 條靶序列間切割基因組DNA，造成DSB［14］。修復DSB 則會造成目標基因組DNA的插入、缺失、替換等，實現(xiàn)基因靶位點的精確編輯。但是，基因組中ZFN 識別靶向位點的有限性、構建的復雜性、高且易變的脫靶率以及分析所需的高成本和高技術限制了其應用［15］。

1.2 TALEN

與ZFN 類似，TALEN 由可自定義的類轉錄激活效應因子（TALE）蛋白DNA 特異性結合域與限制性內切酶FokI 融合而成［16］。TALE 蛋白是由植物致病菌黃單胞菌屬（Xanthomonas）分泌的蛋白，具有轉錄激活功能，可以改變宿主的基因表達［17］。TALE 蛋白利用其DNA 識別結構域與目標基因組中靶位點特異性結合，形成TALE 蛋白二聚體發(fā)揮其核酸內切酶的功能，在TALEN 結合的序列間隔區(qū)域發(fā)生DSB，從而誘發(fā)植物DNA 損傷修復機制［18］。TALE蛋白中的氨基酸重復序列高度相同，其中第12 位和第13 位的雙殘基被稱為重復可變雙殘基（RVD）。TALEN 以一RVD 對一核苷酸的方式靶向位點。通常情況下，TALEN 發(fā)揮其基因編輯功能需要一對TALE 單體結合在14～18 bp 且間隔50～60 bp的目標序列上［19］。相比ZFN，TALEN 更容易設計且對靶基因的特異性識別效率更高。但是RVD的高重復次數(shù)使得TALEN的構建具有挑戰(zhàn)性，另外構建載體過大、成本高等不足同樣限制了其在植物中的廣泛應用。

1.3 CRISPR/Cas 系統(tǒng)

CRISPR/Cas 系統(tǒng)由CRISPR 重復間隔序列和Cas 蛋白組成，是細菌和古細菌中的一種RNA 介導的適應性免疫系統(tǒng)，通過切割入侵者的核酸基因組來防御噬菌體［20］。CRISPR/Cas 系統(tǒng)根據(jù)Cas 基因的數(shù)目和功能分為兩大類，又根據(jù)各自的Cas 基因進一步細分為6 種類型［21］。第一類CRISPR/Cas 系統(tǒng)（類型I、III 和IV）需要多個Cas 蛋白形成復合體行使基因編輯功能，而第二類系統(tǒng)（類型II、V 和VI）通過單個Cas 蛋白與CRISPRRNA（crRNA）的復合體完成基因編輯［22，23］。第二類Ⅱ型的CRISPR/Cas 系統(tǒng)因其結構較簡單，容易操作，是目前研究最透徹、應用最廣的CRISPR/Cas 基因編輯系統(tǒng)，比如CRISPR/Cas9 基因編輯技術［9］。

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)由反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）、crRNA 和Cas9 蛋白組成。前體CRISPR RNA（pre-crRNA）被轉錄后，由tracrRNA 和Cas9蛋白協(xié)助被加工成成熟的小crRNA。tracrRNA、crRNA 和Cas9 蛋白形成復合體，tracrRNA 和crRNA具有序列互補性可形成部分雙鏈結構，保持復合體的穩(wěn)定［24］。CrRNA 被用作引導序列，基于序列互補性將Cas9蛋白引導到靶位點序列區(qū)域，在靶位點序列區(qū)域存在2～5 bp的保守堿基序列（PAM），是tracrRNAcrRNA-Cas9 復合體識別靶位點的關鍵［9，25，26］。Cas9蛋白擁有2 個核酸酶結構域（RuvC 和NHN），在到達靶位點后，其HNH 結構域能夠切割與crRNA 互補的DNA 鏈，RuvC 結構域切割非互補的DNA 鏈，形成DSB［27，28］。依靠植物的內源性修復系統(tǒng)修復DSB，實現(xiàn)基因靶位點的精確編輯。

為了簡化CRISPR/Cas9 系統(tǒng)，將tracrRNA 和crRNA的核心序列用四堿基連接環(huán)構成一個sgRNA（single guide RNA），在sgRNA的引導下Cas9 蛋白仍然能夠特異性地切割靶DNA，這些改進使得CRISPR/Cas9 基因編輯技術操作更加簡便，更利于該技術的廣泛應用［29-31］。雖然CRISPR/Cas9 基因編輯技術成功應用案例越來越多，但該技術仍有編輯位點受限、脫靶等缺點。隨著對CRISPR/Cas 系統(tǒng)研究的深入，新的CRISPR/Cas 系統(tǒng)不斷地被發(fā)現(xiàn)，如CRISPR/Cpf1系統(tǒng)、CRISPR/Cas12b系統(tǒng)和CRISPR/Cas13a系統(tǒng)。CRISPR/Cpf1 系統(tǒng)和CRISPR/Cas12b 系統(tǒng)提高了系統(tǒng)的特異性，擴大了識別應用的范圍，彌補了CRISPR/Cas9 技術的不足［32，33］；CRISPR/Cas13a 系統(tǒng)具有在RNA 水平進行基因編輯的能力，進一步擴展了CRISPR/Cas 系統(tǒng)的編輯范圍［34］。

2 CRISPR/Cas9 基因編輯技術在植物育種中的應用

在植物育種中，CRISPR/Cas9技術主要通過基因的敲除、插入、替換和基因表達調控等手段，改善植物的多種性狀。近年來，已有20多個屬的植物成功應用了CRISPR/Cas9 基因編輯技術［35］。CRISPR/Cas9基因編輯技術在大田作物和林木育種的應用也越來越多，在提高產量、改良品質、培育抗生物脅迫及非生物脅迫新品種等領域都具有良好的應用前景。

2.1 CRISPR/Cas9 基因編輯技術在大田作物中的應用

2013 年，Shan 等［36］利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術在水稻中定點敲除OsPDS基因，獲得的突變體擁有矮小白化的表型。此后，CRISPR/Cas9 基因編輯技術在水稻中得以應用，致力于改善水稻的產量、品種及抗性等。Xu 等［37］敲除水稻粒重基因OsGW2、OsGW5和OsTGW6后，顯著提高稻谷的粒長、粒寬和粒重。Zhou 等［38］敲除水稻中對產量負調控的基因OsGS2、OsGS3和OsGn1a，發(fā)現(xiàn)各單基因突變產量都顯著增加，而且多基因突變對增產有加性效應。Ma等［39］敲除水稻蠟質基因OsWx，成功獲得糯性稻米。Sun 等［40］利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術精確替換水稻中淀粉分支酶基因OsSBEIIb，使得水稻的直鏈淀粉含量顯著增加。OsBadh2基因是水稻香味相關基因，楊平等［41］敲除水稻中OsBadh2基因，水稻突變體中香味物質含量顯著增加。王加峰等［42］靶向敲除水稻中乙烯反應因子基因OsERF922，獲得的突變體在靶位點存在不同的插入或缺失，突變體在苗期和分蘗期均顯著減少了稻瘟病的發(fā)病率。徐鵬等［43］靶向敲除水稻基因OsPi21、OsERF922和OsPita，獲得的三基因突變體顯著增強對部分稻瘟病生理小種的抗性。

CRISPR/Cas9 技術在玉米、小麥、大豆等大田作物中的應用也日趨廣泛。Shi等［44］利用CRISPR/Cas9技術將玉米基因ZmGOS2的啟動子精確替換玉米乙烯負調控因子ZmARGOS8的啟動子，編輯后的突變體的玉米產量不受影響，顯著增加了玉米的抗性能力。Li 等［45］通過靶向編輯玉米溫敏核雄性不育基因ZmTMS5，獲得的突變體擁有熱敏雄性不育性狀。Svitashev 等［46］通過CRISPR/Cas9 技術精確編輯玉米乙酰乳酸合成酶ZmALS2，賦予玉米新材料對除草劑氯磺隆的抗性。Zeng 等［47］靶向敲除玉米耐寒基因負調控因子ZmMPK8，其突變體增強了玉米幼苗的耐寒性。Wang 等［48］利用CRISPR/Cas9 技術對小麥3 個同源基因TaMLO進行敲除，獲得的突變體顯著增強了對白粉病的抗性。Wang 等［49］敲除小麥子粒重基因TaGW2，使編輯后的小麥突變體子粒大小和千粒重顯著增加。Do 等［50］利用CRISPR/Cas9 基因編輯技術同時靶向敲除調控大豆油酸轉化為亞油酸的關鍵酶基因GmFAD2-1A和GmFAD2-1B，雙突變體植株的油酸含量顯著增加至80%以上，而亞油酸含量下降至1.3%～1.7%，并在下一代就創(chuàng)造了無轉基因高油酸大豆純合品種。Wang等［51］利用CRISPR/Cas9 技術精確編輯大豆GmLOX基因，創(chuàng)制了無腥味大豆。Li等［52］靶向敲除大豆GmNAC06基因，其突變體在鹽脅迫過程中耐鹽性顯著增強。

除此以外，其他大田作物也成功實現(xiàn)了CRISPR/Cas9 技術的應用，如馬鈴薯［53］、大麥［54］、棉花［55］等。CRISPR/Cas9 技術在基因水平上對大田作物進行靶基因精準高效編輯，加速了具有優(yōu)異性狀新品種的產生。

2.2 CRISPR/Cas9 基因編輯技術在林木中的應用

林木具有世代周期長、遺傳背景復雜等特點，遺傳育種與性狀改良十分緩慢［35］。CRISPR/Cas9 基因編輯技術的出現(xiàn)，極大地改善了這一現(xiàn)狀。楊樹是木本植物遺傳研究的模式樹種，也是木本植物中CRISPR/Cas9 基因編輯技術發(fā)展最為迅速的樹種。2015年，F(xiàn)an等［56］利用CRISPR/Cas9基因編輯技術成功敲除毛白楊中八氫番茄紅素脫氫酶基因PtPDS，導致楊樹白化表型；同年，Zhou 等［57］成功編輯種間雜種銀灰楊中4-香豆酸輔酶A 連接酶基因Ptr4CL1和Ptr4CL2，獲得莖稈呈紅褐色的突變體材料。Muhr等［58］利用CRISPR/Cas9 技術成功敲除楊樹中的基因PcBRC1-1和PcBRC2-1，敲除株系的分支數(shù)目均顯著增加。Wan 等［59］通過CRISPR/Cas9 技術敲除毛白楊中花青素和原花色素的生物合成負調控基因PtrMYB57后，產生的毛白楊突變體中觀察到高花青素和原花色素表型。

除楊樹以外，CRISPR/Cas9 技術在其他林木中的研究也越來越多。多年生木本植物的童期較長，需要多年栽培才能開花。Charrier 等［60］靶向敲除蘋果和梨的頂花基因MdTFL1.1和PcTFL1.1，兩種敲除株系均有提前開花的表型。Varkonyi-Gasic 等［61］利用CRISPR/Cas9 技術定向突變獼猴成花負調控因子AcCEN和AcCEN4，AcCEN或AcCEN4的突變體均有提前開花的表型。這些研究進展為縮短多年生木本植物的童期，提高雜交育種效率，提供了新的思路和方法。Ren等［62］將CRISPR/Cas9技術引入到葡萄研究中，靶向敲除葡萄細胞中酒石酸合成關鍵酶IdnDH，顯著降低了突變體中酒石酸的含量，證實了該技術應用于葡萄基因組修改的可行性。Peng等［63］通過CRISPR/cas9 技術靶向修飾柑橘潰瘍病易感基因CsLOB1啟動子區(qū)域的效應子結合元件（EBEPthA4），提高了柑橘的抗病能力。Gomez 等［64］靶向敲除木薯的兩個轉錄起始因子基因ManCBP-1和ManCBP-2，抑制了由褐斑條紋病毒引起的木薯褐紋病的病害癥狀。

以上CRISPR/Cas9 技術在各林木植物上的成功應用，為CRISPR/Cas9 系統(tǒng)應用于桑樹提供了理論基礎和技術方法。

3 CRISPR/Cas9 基因編輯技術在桑樹中的應用展望

目前桑樹主要采用傳統(tǒng)育種和分子標記輔助育種來培育更好的品種，但這些方法需要較長的時間，育種進程十分緩慢。隨著傳統(tǒng)基因工程技術被應用于桑樹育種研究，基因工程育種雖然取得了一定的研究進展，豐富了育種手段，但是桑樹育種效率并沒有顯著的提高。CRISPR/Cas9 技術的出現(xiàn)為桑樹育種工作帶來了新的技術方法，其簡便高效已在多種植物中得到證實，該技術應用在桑樹研究中將是一大技術革新。

3.1 傳統(tǒng)基因工程在桑樹育種的應用

桑樹的基因工程研究由來已久，不斷突破桑樹遺傳轉化和組織再生等技術難題［65-68］。通過基因槍法、根癌農桿菌介導法、電穿孔法和活體轉化法等多種技術對桑樹進行外源基因的遺傳轉化已經有報道［66，67，69-71］。2003 年，Bhatnagar 等［72］在桑 樹品種 印度桑K2 中發(fā)展了一種高效、可重復、轉化效率高的桑樹轉基因技術。近年來，該技術得到不斷的改進發(fā)展，用子葉和下胚軸等外植體轉化印度桑K2，轉化效率可達20%～60%。

經過多年的發(fā)展，轉基因技術在桑樹育種中的研究有較大的進展［73］。談建中等［74］為了獲得高蛋白桑樹品種，將大豆球蛋白A1aB1b基因轉入桑樹品種新之一瀨，通過分子檢測結果顯示成功獲得了轉基因桑樹植株。管志文等［75］將柞蠶抗菌肽D 基因成功轉入桑樹品種新之一瀨，獲得的轉基因桑苗對桑樹青枯病的抗性顯著增強。王勇等［76］將抗菌肽shivaA基因轉入桑樹品種豐馳桑，成功獲得轉基因植株，經抗病性測定，證明轉基因植株對順德型桑樹青枯病菌株具有不同程度的抗病性。Lal 等［77］和Checker 等［78］將不同啟動子驅動的大麥胚胎晚期豐度基因Hva1基因導入印度桑K2 中，在組成啟動子actin1的驅動下表達Hva1基因，顯著增強了桑樹的耐旱和耐鹽性；而大麥Hva1基因在脅迫誘導啟動子rd29A的控制下，可以有效阻止桑樹在非脅迫條件下的生長遲緩，并賦予轉基因桑樹耐寒性。Das等［79］將由CaMV35S啟動子和rd29A啟動子分別驅動的煙草脅迫響應基因Osmotin轉入到印度桑K2 中，由CaMV35S啟動子驅動的Osmotin基因，賦予轉基因桑樹對非生物脅迫和生物脅迫的耐受性。當Osmotin基因由rd29A啟動子驅動表達時，轉基因桑樹則表現(xiàn)出耐旱和耐鹽性。Sajeevan 等［80］將擬南芥蠟質相關基因AtSHN1轉入到印度桑M5 中，轉基因桑葉表現(xiàn)出深綠色光澤，表面蠟質含量增加，相比受體桑樹葉片保水能力更好。Saeed 等［81］將水稻Osbch1轉入到印度桑M5 中，轉基因植株表現(xiàn)出更高水平的類胡蘿卜素。

桑樹的遺傳轉化體系已趨于成熟，相關研究也越來越多。目前桑樹轉基因的研究多為外源基因轉入桑樹中，以期獲得優(yōu)良性狀的桑樹新品種，但是對桑樹基因的基礎研究較少，桑樹轉基因可操作的目標基因有限。人們對轉基因技術有抵觸情緒阻礙了轉基因品種的應用與推廣，因此桑樹轉基因的研究成果多為實驗室研究，未能進行田間應用。桑樹是多年生木本植物，桑樹轉基因研究多為目的基因在桑樹中的過量表達。隨著桑樹的生長發(fā)育，轉入目的基因的表達豐度很難維持高水平，從而造成目的性狀逐漸消失。

綜上所述，傳統(tǒng)基因工程本身的局限性與桑樹的特殊性導致傳統(tǒng)基因工程桑樹育種研究的發(fā)展滯緩，很難得到廣泛應用。CRISPR/Cas9 基因編輯技術的出現(xiàn)并不斷地成功應用于多種植物中，利用該技術進行作物育種研究的優(yōu)勢已經顯而易見。目前，CRISPR/Cas9 技術在桑樹育種中的研究還未見報道，但是隨著桑樹基因組信息的完善和桑樹基因研究的開展，CRISPR/Cas9 技術將在桑樹的基因功能研究和遺傳育種方面發(fā)揮重要作用。

3.2 CRISPR/Cas9 基因編輯技術應用于桑樹的優(yōu)勢分析

CRISPR/Cas9 基因編輯技術是繼轉基因技術后的一項新的技術，在未來桑樹遺傳育種和性狀改良方面有巨大的潛力。該技術能夠對桑樹基因定向精確編輯，消除不需要的性狀或者在優(yōu)質品種中添加所需要的性狀，大大提高遺傳改良效率［82］。本文探討CRISPR/Cas9 技術應用于桑樹育種中的可能性及優(yōu)勢，以期為將來的桑樹遺傳育種和基因功能研究提供新的思路和方法。

1）CRISPR/Cas9 技術的應用依賴于桑樹的遺傳轉化和組織再生等技術。隨著轉基因技術在桑樹育種和基因功能研究工作的不斷開展，桑樹的遺傳轉化和組織再生等技術趨于成熟，為CRISPR/Cas9 技術在桑樹中應用提供了技術條件。

2）在桑樹的基礎研究中，CRISPR/Cas9 技術更加簡便高效，并且編輯靶基因后的表型性狀更加穩(wěn)定，相比轉基因技術沒有其他外源序列的干擾，有利于桑樹基因的功能研究。

3）桑樹的幼年期較長，需要3 年以上才能開花結果，不利于傳統(tǒng)桑樹育種工作。利用CRISPR/Cas9技術成功編輯的桑樹，只需一個世代或者可直接應用于生產實踐，試驗研究到田間應用的時間大幅度縮減。相比于轉基因技術，CRISPR/Cas9 技術是在桑樹基因組層面進行定點編輯，沒有基因過量表達和轉入位點位置效應等情況的干擾，目標性狀穩(wěn)定可靠，隨著桑樹的生長發(fā)育不會有太大的變化，更適合于桑樹的遺傳育種和性狀改良。

4）CRISPR/Cas9 技術在桑樹中的應用范圍將極為廣泛，例如蠶桑的桑葉增產、藥桑的藥物活性分子的含量富集、飼料桑的桑葉蛋白質含量的增加、食用桑的桑葉營養(yǎng)成分的富集和食用口感改善、生態(tài)桑的生物脅迫和非生物脅迫的抗性等，都將有其用武之地。

綜上所述，新技術CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)相比較傳統(tǒng)基因工程技術更適合于桑樹的育種研究，具有很大的優(yōu)勢和應用前景。但是，隨著CRISPR/Cas9技術的廣泛應用，其基因編輯的局限性也逐漸顯現(xiàn)，例如脫靶效應和編輯位點的限制等。因此建立起高效的sgRNA 數(shù)據(jù)庫，開展廣泛的基因功能研究，開發(fā)新的基因編輯技術將會是CRISPR/Cas9 基因編輯技術應用于桑樹研究后的重要工作。隨著桑樹基因組學、轉錄組學和代謝組學的研究工作不斷開展和新的基因編輯技術CRISPR/Cpf1、CRISPR/Cas12b 和CRISPR/Cas13a的出現(xiàn)，基因編輯技術應用于桑樹的障礙不斷被清除，未來基因編輯技術將會和傳統(tǒng)育種方法、轉基因技術一起在桑樹育種工作中發(fā)揮作用，為桑樹多元化種質創(chuàng)制做出巨大貢獻。