基因組學(xué)在干眼研究中的應(yīng)用進(jìn)展

沈乎醒，高衛(wèi)萍，韋慶波，徐 倩

0引言

干眼是一種淚膜失去穩(wěn)定性，伴有眼表不適癥狀的常見疾病，全球發(fā)病率約為5%～50%，我國發(fā)病率為21%～68.3%[1]。干眼的眼表不適癥狀，如干澀、異物感、燒灼感、刺痛感等，治療困難，嚴(yán)重影響患者的工作和生活。2017年國際眼表和淚膜協(xié)會(huì)第二次會(huì)議(TFOS DEWS Ⅱ)強(qiáng)調(diào)干眼的主要發(fā)病機(jī)制是淚膜高滲和不穩(wěn)定、眼表炎癥和損傷以及神經(jīng)感覺異常，年齡、性別、用眼方式、滴眼液中的防腐劑和全身性藥物、隱形眼鏡、眼科手術(shù)和非手術(shù)治療都可能導(dǎo)致干眼[2]。未來干眼的研究需要進(jìn)一步的流行病學(xué)調(diào)查以更好地確定風(fēng)險(xiǎn)因素，創(chuàng)造出毒性更小的藥物，設(shè)計(jì)出創(chuàng)傷更小的眼科手術(shù)，基因組學(xué)的發(fā)展為這些研究打開了新的局面。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)(Western blot)、基因組學(xué)等技術(shù)的廣泛運(yùn)用，進(jìn)一步明確了干眼患者眼表細(xì)胞因子和淚液成分的變化。宏基因組學(xué)、基因工程動(dòng)物、基因芯片及基因轉(zhuǎn)染研究的開展，為深入研究干眼的發(fā)病機(jī)制，研發(fā)治療干眼的新藥提供了良好的條件。

1宏基因組學(xué)在干眼發(fā)病率研究中的運(yùn)用

在已報(bào)告的干眼發(fā)病率調(diào)研中，超過40歲的患者約38%～68%有瞼板腺功能障礙(MGD)[2]。研究表明，眼表微生物群與MGD導(dǎo)致的干眼密切相關(guān)，但因?yàn)闇I膜的抗菌特性和淚液的機(jī)械沖刷，只有零星的眼表區(qū)域被微生物定殖，細(xì)菌培養(yǎng)技術(shù)有限，無法準(zhǔn)確檢測(cè)[3]。宏基因組學(xué)的技術(shù)可以分析復(fù)雜環(huán)境群落微生物，甚至包括不可培養(yǎng)的微生物[4]。

Li等[5]提取了35例40歲以上的干眼患者(其中25例診斷有MGD)球結(jié)膜多個(gè)部位拭子樣本中細(xì)菌的DNA，并用PCR技術(shù)擴(kuò)增RNA，繼而采用QIIME軟件對(duì)細(xì)菌16SrRNA基因V3-V4可變區(qū)進(jìn)行測(cè)序，分析結(jié)膜樣本中微生物群落OTU聚類及多樣性。不僅區(qū)分了易致干眼的細(xì)菌以及益于眼表健康的菌落，還發(fā)現(xiàn)假單胞菌、巴氏桿菌等才是MGD的關(guān)鍵致病菌，而金黃色葡萄球菌和痤瘡丙酸桿菌則與MGD的發(fā)病無明顯相關(guān)性。MGD導(dǎo)致的干眼與年齡也有關(guān)，研究指出老年小鼠MGD與人類MGD患者表現(xiàn)的眼表癥狀相似[6]。人與小鼠的基因有80%相同，Parfitt等[7]摘取3月齡和2歲共10只小鼠的瞼板腺等組織，采用高通量基因測(cè)序方法讀取組織中提取的DNA并制成了宏基因組文庫，對(duì)不同年齡小鼠的瞼板腺等組織進(jìn)行差異基因表達(dá)分析，結(jié)果顯示有698個(gè)基因被鑒定為差異表達(dá)，確定了包括成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)和Wnt在內(nèi)的數(shù)條信號(hào)通路在瞼板腺隨著年齡發(fā)生功能障礙的過程中產(chǎn)生重要作用，為進(jìn)一步研究MGD導(dǎo)致干眼的機(jī)制提供了基礎(chǔ)。IL-2受體α鏈(CD25)是IL-2的結(jié)合受體,CD25基因敲除(CD25KO)小鼠表現(xiàn)出干燥綜合征(Sj?gren綜合征)的多種特征，包括雙眼皮腺炎、眼瞼腺炎和角膜結(jié)膜炎等[8]。Zaheer等[9]比較了飼養(yǎng)在常規(guī)和無菌條件下的CD25KO小鼠，無菌飼養(yǎng)的CD25KO小鼠與常規(guī)的相比，結(jié)膜杯狀細(xì)胞密度降低，角膜屏障功能障礙明顯，CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)增多。將野生型C57BL/6J小鼠糞便的微生物移植給無菌CD25KO小鼠，可逆轉(zhuǎn)無菌CD25KO小鼠的自發(fā)性干眼表型。研究表明，體內(nèi)共生微生物的缺乏可加速淚腺炎癥發(fā)生、加重其嚴(yán)重程度，并產(chǎn)生了具有更強(qiáng)致病性的CD4+T細(xì)胞，共生微生物或其代謝產(chǎn)物具有保護(hù)外分泌腺的免疫調(diào)節(jié)特性。宏基因組學(xué)揭示了微生物在干眼發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制中的重要地位，為精確治療干眼提供了新的靶點(diǎn)。

2基因芯片在干眼炎癥機(jī)制研究中的運(yùn)用

淚液中含有復(fù)雜的細(xì)胞因子成分，可調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能，也可作為干眼發(fā)生的眼表標(biāo)志物和疾病康復(fù)的信號(hào)。由于淚液樣本微量，ELISA只能檢測(cè)樣本中復(fù)雜的細(xì)胞因子中的個(gè)別因子的濃度，想要得到淚液中各種細(xì)胞因子之間相互作用和整體變化的結(jié)果，需要大量檢測(cè)樣本，操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力?；蛐酒址QDNA微陣列，可以通過生物發(fā)光、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)雜交探針的位置，與大量被測(cè)生物細(xì)胞或組織標(biāo)記的核酸序列雜交后，實(shí)現(xiàn)基因信息的快速檢測(cè)[10]?；蛐酒夹g(shù)具有高通量、高靈敏度、高特異性的特點(diǎn)，非常適合于同時(shí)檢測(cè)微量淚液樣本中的多個(gè)細(xì)胞因子[11]。

Li等[12]采用細(xì)胞因子基因芯片檢測(cè)干眼模型鼠淚液中炎癥因子、抗炎因子、生長(zhǎng)因子以及其他細(xì)胞凋亡因子等，發(fā)現(xiàn)B7-2/Cd86、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-8、Fas配體、TNF-α和TIMP-1較正常水平升高?；蛐酒夹g(shù)也可用于分析不同疾病導(dǎo)致干眼的淚液成分的特異性變化，為預(yù)防繼發(fā)性干眼提供早期診斷和療效評(píng)估的實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。例如曾孝宇[13]通過人干眼定量抗體基因芯片(QAH-DED-1)檢測(cè)糖尿病干眼患者的淚液樣本，發(fā)現(xiàn)干眼患者淚液中EGF、IL-1RA及MIP-1d較非干眼糖尿病患者的有明顯趨勢(shì)變化，這些細(xì)胞因子或許可以成為糖尿病性干眼早期診斷的標(biāo)志物。Gad等[14]用多重細(xì)胞因子抗體基因芯片測(cè)定配戴硅水凝膠角膜軟性接觸者淚液中7種細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、IFN-γ、TNF-α的濃度，顯示有干眼眼部癥狀的配戴者促炎細(xì)胞因子IL-17A水平較高，證實(shí)了角膜軟性接觸鏡導(dǎo)致的干眼眼部癥狀與眼表炎癥有關(guān)。Zhang等[15]運(yùn)用細(xì)胞因子基因芯片數(shù)據(jù)檢測(cè)鬼針草水提取物對(duì)干眼模型鼠淚液中細(xì)胞因子B7-2/Cd86、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10、MMP-8、FasL、TNF-α和TIMP-1的作用，為進(jìn)一步選擇合適的細(xì)胞因子進(jìn)行Western blot、檢驗(yàn)鬼針草的抗炎作用提供了便利。

3基因轉(zhuǎn)染在干眼新藥研究中的運(yùn)用

在干眼流行病學(xué)調(diào)查中，根據(jù)癥狀報(bào)告得出的疾病總發(fā)病率在14.4%～24.4%，根據(jù)體征報(bào)告得出的則為1.3%～10.4%[2]，神經(jīng)病理性疼痛在干眼發(fā)病機(jī)制中有重要作用，是導(dǎo)致干眼癥狀和體征分離的主要原因。干眼淚液分泌減少以及炎癥均可激活角膜傷害性感受器，導(dǎo)致疼痛不適癥狀[16]。角膜的傷害感受器包括機(jī)械神經(jīng)感受器、多模態(tài)-嗅覺傳感器以及冷熱覺感受器[17]。Yang等[18]將不同濃度的角膜冷覺TRPM8受體激動(dòng)劑cryosim-3(C3，1-二異丙基膦?；赏?溶液用于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人TRPM8 cDNA的中國倉鼠卵巢細(xì)胞，測(cè)試細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員曲線，從而篩選有效激動(dòng)劑濃度，經(jīng)過鼠感覺神經(jīng)元鈣反應(yīng)試驗(yàn)后，最終選取合適的cryosim-3濃度(2mg/mL)溶液用于干眼患者眼表，證實(shí)cryosim-3溶液可緩解干眼患者眼表燒灼感等不適癥狀，為治療干眼提供了新型的藥物和研究方法。

眼部的基因治療具有局限性，角膜和結(jié)膜、上皮和淚膜以及如眨眼或淚膜間隙等生理機(jī)制限制了DNA有效地滲透到眼球?；钚苑肿优c納米載體的結(jié)合，使分子能與特定的眼球結(jié)構(gòu)緊密地相互作用，克服解剖和生理障礙，延長(zhǎng)DNA在靶組織中的停留時(shí)間[19]。MUC5AC是一種具有凝膠形成特性的糖蛋白，Contreras-Ruiz等[20]將含有加載了編碼修飾的MUC5AC蛋白的納米質(zhì)粒的陽離子化明膠覆蓋在健康和實(shí)驗(yàn)性干眼小鼠的角膜上，成功地在角膜和結(jié)膜上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染了MUC5AC蛋白，修正了干眼小鼠眼表組織MUC5AC的表達(dá)，使其眼表組織的結(jié)構(gòu)和形態(tài)趨于正常，炎癥因子水平下降，CD4+T細(xì)胞浸潤(rùn)減少，干眼癥狀明顯減輕[21]。將基因轉(zhuǎn)染技術(shù)和納米分子材料學(xué)技術(shù)相結(jié)合，更加有效地為研發(fā)治療干眼新藥物提供了新的技術(shù)。

4基因測(cè)序在干眼手術(shù)治療中的運(yùn)用

越來越多的患者尋求眼部護(hù)理和整容手術(shù)，如長(zhǎng)期配戴角膜鏡和使用含有防腐劑的滴眼液、多次眼表手術(shù)等都可能使角膜上皮損傷、角膜緣干細(xì)胞(LESCs)功能障礙或缺損，出現(xiàn)干眼。癥狀嚴(yán)重者可有眼瞼痙攣、劇烈疼痛，甚至失明[22]。1989/1994年先后報(bào)道了成功完成人自體LESCs移植和人同種異體LESCs移植重建角膜表面，治療眼表損傷和LESCs缺乏[23-24]，研究人員從1997年開始進(jìn)行體外擴(kuò)增的LESCs研究。明確角膜上皮的表型是成功獲得體外擴(kuò)增LESCs的關(guān)鍵因素[25]。由于缺乏LESCs的特異性生物標(biāo)志物和原位上皮細(xì)胞亞群的精確分子表征，這一生物工程領(lǐng)域的進(jìn)展受到了實(shí)質(zhì)性的阻礙。Bath[26]利用激光捕獲顯微解剖和RNA測(cè)序相結(jié)合的方法，對(duì)人類角膜上皮細(xì)胞的原位亞群進(jìn)行分析，進(jìn)行全局轉(zhuǎn)錄組分析，明確了原位角膜上皮亞群的綜合分子表征，獲得了適合LESCs的選擇性體外擴(kuò)增的有效低氧濃度和培養(yǎng)基，為通過培養(yǎng)的角膜上皮移植治療角膜緣上皮干細(xì)胞缺乏提供了大量的數(shù)據(jù)。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)被認(rèn)為是值得進(jìn)一步探索的可以限制組織破壞的修復(fù)細(xì)胞[27]。Lee等[28]將小鼠骨髓衍生間充質(zhì)干細(xì)胞(mMSCs；1×105cells/20μL；BSS)注射到干眼模型鼠淚腺中，與注入PBS緩沖液的淚腺組織進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果顯示淚腺注射mMSCs后組織中CD4+細(xì)胞浸潤(rùn)減少，IL-2和IFN-γ表達(dá)水平下降；瞼結(jié)膜的杯狀細(xì)胞的數(shù)量明顯增加、黏液的分泌量也有所增加；萎縮的淚腺結(jié)構(gòu)在局部灌注mMSCs后也有部分恢復(fù)，表明MSCs可以通過抑制炎癥，促進(jìn)組織修復(fù)來保護(hù)眼表。干細(xì)胞的培養(yǎng)和移植依賴在干眼領(lǐng)域的研究還有可以探索的廣泛內(nèi)容，運(yùn)用好基因組學(xué)的技術(shù)，可以促進(jìn)干細(xì)胞在干眼領(lǐng)域運(yùn)用的長(zhǎng)足進(jìn)步。

5基因工程動(dòng)物在干眼動(dòng)物造模研究中的運(yùn)用

基因工程動(dòng)物的發(fā)展為復(fù)雜性狀疾病的研究提供了理想的動(dòng)物模型，可以在活體內(nèi)分析單個(gè)候選基因的作用，將復(fù)雜的問題拆解開分析，分別對(duì)單一因素進(jìn)行分析，為深入研究發(fā)病機(jī)制和基因治療創(chuàng)造了條件[29]。淚腺功能障礙使淚液分泌減少，引發(fā)干燥、導(dǎo)致炎癥反應(yīng)是干眼重要的發(fā)病機(jī)制之一。

低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)可調(diào)控炎癥因子和免疫細(xì)胞表達(dá)[30]。Ji等[31]將HIF-1α條件性基因敲除的C57BL/6小鼠和野生型C57BL/6小鼠共同放置設(shè)定的干燥環(huán)境并皮下注射氫溴酸東莨菪堿(5mg/mL)誘導(dǎo)干眼，結(jié)果顯示HIF-1α基因敲除的小鼠淚腺腺泡細(xì)胞中CD45+細(xì)胞的浸潤(rùn)顯著增強(qiáng)，TRAIL基因表達(dá)水平較野生型明顯降低，炎癥因子IL-1β、IL-17A蛋白表達(dá)水平顯著升高，誘導(dǎo)加速了腺泡細(xì)胞死亡。該研究為淚腺腺泡細(xì)胞衍生的TRAIL在炎癥性損傷中的調(diào)節(jié)功能提供了新的見解。淚膜的穩(wěn)定性對(duì)干眼眼表的健康也很重要，淚液的脂質(zhì)層可維持淚膜穩(wěn)定性，磷脂轉(zhuǎn)移蛋白(PLTP)是人類淚液脂質(zhì)層的正常成分。為了研究PLTP在淚膜穩(wěn)定性中能否起到功能作用，Set?l?等[32]采用野生型C57BL/6小鼠和PLTP敲除的C57BL/6小鼠，均進(jìn)行干眼誘導(dǎo)。PLTP敲除小鼠的角膜上皮損傷、上皮羧基熒光素通透性以及閉塞素裂解較野生型小鼠明顯加重。提示淚液中PLTP的存在對(duì)維持健康和功能正常的眼表是必不可少的?；蚬こ虅?dòng)物可以將干眼復(fù)雜和混合的發(fā)病機(jī)制拆解開，深入研究發(fā)病機(jī)制，為進(jìn)一步研究新型的治療藥物和手段提供方法。

6結(jié)語

新一代基因組學(xué)技術(shù)使臨床醫(yī)生和研究人員能夠從大規(guī)模研究群體中收集基因組數(shù)據(jù)量，結(jié)合新的信息學(xué)方法將多種數(shù)據(jù)與基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行集成后，更好地理解疾病機(jī)制和藥物反應(yīng)[33]。“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)”這一概念被提出后，臨床上對(duì)基因組學(xué)的高通量測(cè)序技術(shù)需求越來越多。目前基因組學(xué)在干眼研究的主要側(cè)重于細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的變化，腸道和眼表微環(huán)境菌落的多樣性宏基因測(cè)序、炎癥及凋亡細(xì)胞因子基因芯片檢測(cè)，這些先進(jìn)技術(shù)的運(yùn)用為臨床醫(yī)生提供了較多較完善的干眼發(fā)病原因和發(fā)病機(jī)制的研究結(jié)論，利于指導(dǎo)臨床醫(yī)生制定更精準(zhǔn)的治療方案。此外，基因組學(xué)多重技術(shù)對(duì)治療干眼新藥和新治療技術(shù)研發(fā)等提供科學(xué)支撐，目前已有跨學(xué)科的研究，基因組學(xué)結(jié)合材料學(xué)、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)等，不僅為眼表疾病，更為難治性、遺傳性眼底視網(wǎng)膜病變帶來治療的希望。在未來的研究中，更加側(cè)重于基因組學(xué)對(duì)干眼發(fā)病率、組織的修復(fù)和重建的作用，為尋找更加快速有效的診斷和治療方案以及疾病的預(yù)后提供新的思路。