TRPM3/miR-204復(fù)合位點(diǎn)調(diào)控眼部疾病的研究進(jìn)展

張瑞雪，何 媛

0引言

眼部疾病復(fù)雜多樣，隨著對(duì)其發(fā)病機(jī)制的不斷深入探究，基因預(yù)防和基因治療逐漸成為研究熱點(diǎn)之一。瞬時(shí)受體電位(TRP)通道蛋白是細(xì)胞膜上的一類(lèi)非選擇性陽(yáng)離子通道蛋白家族，TRPM3是TRP家族M亞家族中的一員，對(duì)鈣離子和鎂離子具有一定通透性。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于從病毒到人類(lèi)的各種生物中，通過(guò)對(duì)翻譯水平的抑制或斷裂靶mRNAs來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。目前發(fā)現(xiàn)上百種miRNA在眼組織中呈不同程度表達(dá)，并與多種眼部疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，如血清中miR-23a和miR-34a表達(dá)上調(diào)通過(guò)促進(jìn)炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)從而參與年齡相關(guān)性黃斑變性(ARMD)的發(fā)生及發(fā)展；糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)患者血清miR-146a明顯降低，可能通過(guò)介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和血管增生參與DR的發(fā)病[1-2]。越來(lái)越多的研究表明，TRPM3/miR-204復(fù)合位點(diǎn)在眼組織的發(fā)育和眼部疾病的表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本文就TRPM3/miR-204分子通路的生物學(xué)功能、在眼部的表達(dá)與調(diào)控及其與眼部疾病的相關(guān)性研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 TRPM3/miR-204

TRP陽(yáng)離子通道超家族在細(xì)胞的感應(yīng)、黏附、增殖、分化和凋亡等多種細(xì)胞過(guò)程中起重要作用。TRPM3是TRP家族M亞家族中成員之一，編碼質(zhì)膜上的陽(yáng)離子通道蛋白。TRPM3基因是位于人類(lèi)9號(hào)染色體(9q21.11-q21.12)長(zhǎng)臂上最大的基因之一，其長(zhǎng)度超過(guò)0.9Mb[3]。有研究證實(shí)TRPM3的兩種錯(cuò)義突變可導(dǎo)致人類(lèi)遺傳性白內(nèi)障[4]，Bennett等[5]初步研究發(fā)現(xiàn)TRPM3內(nèi)含子2的基因突變與年齡相關(guān)性白內(nèi)障相關(guān)。TRPM3的非編碼區(qū)突變與長(zhǎng)壽、低密度脂蛋白及甘油三酯升高、系統(tǒng)性硬化癥、阿司匹林加重性呼吸系統(tǒng)疾病和甲狀腺結(jié)節(jié)有關(guān)[6-10]。而TRPM3編碼區(qū)變異可能導(dǎo)致智力障礙和癲癇[11]。TRPM3通道對(duì)溫度敏感，研究顯示其在傳感有害溫度、調(diào)節(jié)胰島素釋放和分泌炎性因子方面發(fā)揮一定作用[12-13]。

TRPM3含有非編碼miRNA基因，與宿主基因同方向共轉(zhuǎn)錄，通過(guò)對(duì)靶mRNAs的切割或抑制mRNAs翻譯參與轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)的調(diào)控。miR-204位于TRPM3內(nèi)含子6上[14]，通過(guò)調(diào)控多種基因的表達(dá)增加TRPM3位點(diǎn)的功能復(fù)雜性。因此，miR-204的表達(dá)受TRPM3啟動(dòng)子調(diào)控，也受表觀(guān)遺傳機(jī)制的調(diào)控[15]。miR-204與TRPM3轉(zhuǎn)錄方向相同[16]，有研究表明miR-204的表達(dá)模式也與TRPM3大致相同。如在眼部晶狀體、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜神經(jīng)元、睫狀體和視網(wǎng)膜色素上皮(RPE)細(xì)胞中可同時(shí)檢測(cè)到miR-204和TRPM3[16-21]。TRPM3和miR-204也在胰島素瘤細(xì)胞中共表達(dá)，miR-204可以調(diào)節(jié)胰島素的生成[22]。TRPM3在伴有VHL基因丟失的人腎透明細(xì)胞癌(ccRCC)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中也起重要作用，miR-204的直接靶點(diǎn)TRPM3在缺失VHL基因的腎透明細(xì)胞癌中表達(dá)增加[23]。Butrym等[24]發(fā)現(xiàn)位于miR-204上游側(cè)翼的基因突變可造成急性髓系白血病惡化。因此，了解不同特定的TRP通道/miRNA分子通路可能為疾病的靶向治療提供臨床依據(jù)。

2 TRPM3/miR-204在眼部的表達(dá)及調(diào)控

在人眼部，多個(gè)TRPM3轉(zhuǎn)錄變體存在于晶狀體中[5]，且成人RPE細(xì)胞系(ARPE-19)的TRPM3轉(zhuǎn)錄水平更接近原代RPE細(xì)胞[25]。RNA測(cè)序證實(shí)，TRPM3在人RPE組織、細(xì)胞系和晶狀體干細(xì)胞系中比視網(wǎng)膜或角膜源性細(xì)胞中更豐富[26-27]。許多學(xué)者在人睫狀體、小梁網(wǎng)(HTM)細(xì)胞、晶狀體上皮中檢測(cè)到miR-204轉(zhuǎn)錄[28-29]，miR-204可調(diào)節(jié)HTM細(xì)胞中多個(gè)基因的表達(dá)，蛋白質(zhì)印跡分析顯示miR-204的直接靶點(diǎn)蛋白Bcl2l2、BIRC2、EZR、M6PR、SERP1表達(dá)水平均下調(diào)[29]。miR-204是睫狀體中表達(dá)含量最多的miRNA，也在角膜、小梁網(wǎng)等與青光眼和圓錐角膜相關(guān)的眼組織中表達(dá)[30]。TRPM3免疫定位于人胎兒RPE(hf-RPE)細(xì)胞的頂漿膜亞區(qū)，并富集于頂漿細(xì)胞緊密連接處和初級(jí)纖毛基底處[31]。小眼球畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)參與TRPM3/miR-204分子通路的調(diào)控，在去分化的hf-RPE細(xì)胞中MITF和TRPM3/miR-204顯著下調(diào)，將前體miR-204轉(zhuǎn)染到hf-RPE細(xì)胞中，可促進(jìn)細(xì)胞分化；而加入miR-204抑制劑則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞去分化。在hf-RPE細(xì)胞中，敲除MITF會(huì)降低TRPM3/miR-204及其他RPE分化基因(如TYR、TYRP1) 的表達(dá)，導(dǎo)致hf-RPE細(xì)胞去分化；相反，MITF和前體miR-204共轉(zhuǎn)染促進(jìn)了hf-RPE細(xì)胞分化，這說(shuō)明MITF介導(dǎo)的miR-204上調(diào)在促進(jìn)hf-RPE細(xì)胞分化中起關(guān)鍵作用[32]。TRPM3/miR-204復(fù)合位點(diǎn)在眼組織中呈不同程度表達(dá)，且在多種眼部疾病的調(diào)控中也扮演重要角色。

3 TRPM3/miR-204與眼部疾病

3.1 TRPM3與白內(nèi)障TRPM3是晶狀體發(fā)育和白內(nèi)障形成的相關(guān)基因之一。Bennett等[5]首次證明TRPM3與人類(lèi)遺傳性眼病有關(guān)，并定位于染色體9q上，進(jìn)一步證明該陽(yáng)離子通道在正常眼組織發(fā)育中的重要作用。人類(lèi)9q染色體上的TRPM3是引起常染色體顯性遺傳性白內(nèi)障和高眼壓性青光眼的發(fā)病基因。全外顯子測(cè)序和下一代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出TRPM3的外顯子3中存在與疾病共分離的A/G雜合轉(zhuǎn)變[5]；作為選擇性剪接的結(jié)果，這種錯(cuò)義突變可能會(huì)導(dǎo)致TRPM3轉(zhuǎn)錄變體9上密碼子65的蛋氨酸被異亮氨酸替代，以及導(dǎo)致密碼子8在人晶狀體中表達(dá)一種新的TRPM3轉(zhuǎn)錄變體。對(duì)重組TRPM3-GFP熒光蛋白基因產(chǎn)物的瞬時(shí)表達(dá)研究顯示，I/M的替代引入了1個(gè)可變的翻譯起始位點(diǎn)，該位點(diǎn)位于其他8個(gè)TRPM3轉(zhuǎn)錄變體的蛋氨酸上游密碼子89上[5]。另外，在23例中國(guó)兒童散發(fā)白內(nèi)障患者中也檢測(cè)到位于TRPM3外顯子29的錯(cuò)義突變[33]。

3.2 miR-204與白內(nèi)障研究表明，miR-204的異常表達(dá)可能導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞凋亡、晶狀體纖維細(xì)胞紊亂和晶狀體透明度降低，從而形成白內(nèi)障[34]。miR-204的差異調(diào)控與年齡相關(guān)性白內(nèi)障、先天性白內(nèi)障、糖尿病性白內(nèi)障和后發(fā)性白內(nèi)障/后囊膜混濁(PCO)的形成相關(guān)[35-38]。在年齡相關(guān)性白內(nèi)障手術(shù)患者中，miR-204-5p和miR-204-3p在晶狀體上皮中央表達(dá)下調(diào)超過(guò)2倍[37]。在PCO組織和晶狀體上皮細(xì)胞(LECs)中，miR-204-5p和miR-204-3p也顯著下調(diào)。原代LECs中miR-204-5p過(guò)表達(dá)導(dǎo)致鈣黏蛋白表達(dá)增加；而上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標(biāo)志物、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和波形蛋白表達(dá)減少。miR-204過(guò)表達(dá)直接作用于DNA結(jié)合蛋白SMAD4來(lái)加強(qiáng)抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β2(TGF-β2)介導(dǎo)的EMT[38]。miR-204通過(guò)靶向TGF-β/SMAD信號(hào)通路而直接抑制EMT，可能成為治療PCO的新靶點(diǎn)。miR-204也與白內(nèi)障氧化應(yīng)激相關(guān)基因的調(diào)控相關(guān)。miR-204不僅抑制促氧化基因如硫氧還蛋白相互作用蛋白(TXNIP) 3’-UTR的轉(zhuǎn)錄，還激活了抗氧化基因如乙醛脫氫酶1A3(ADH1A3)的5’-TATA-box啟動(dòng)子序列轉(zhuǎn)錄[37]。因此，miR-204的下調(diào)抑制抗氧化基因并激活促氧化基因，揭示了一種新的參與白內(nèi)障發(fā)病機(jī)制的miR204-TATA box/3’-UTR基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。秦宇等[39]研究發(fā)現(xiàn)miR-204在年齡相關(guān)性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中呈高表達(dá)，且miR-204通過(guò)靶向調(diào)控Bcl-2家族成員bcl-2、mcl-1使其表達(dá)降低，從而在年齡相關(guān)性白內(nèi)障發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

3.3 miR-204與青光眼miR-204是參與小梁網(wǎng)細(xì)胞調(diào)控通路的基因之一[40]，而小梁組織是房水的流出途徑，與青光眼的病理過(guò)程密切相關(guān)。G蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白5(RGS5)是HTM細(xì)胞中表達(dá)的非管家基因之一，Banaei-Esfahani等[41]發(fā)現(xiàn)miR-204可能靶向調(diào)控RGS5蛋白而參與青光眼的發(fā)病。在晚期青光眼高眼壓視網(wǎng)膜損傷大鼠模型中，miR-204下調(diào)了約4倍，還有其他7個(gè)miRNAs也顯著下調(diào)。這些基因富集于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，并且與EMT相關(guān)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-204對(duì)TGF-β信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，即抑制miR-204表達(dá)可激活該通路的下游成分[42]。在視神經(jīng)損傷模型大鼠的視網(wǎng)膜血管中，miR-204表達(dá)水平顯著升高，生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43(GAP-43)表達(dá)降低；在大鼠眼部注射miR-204模擬物后，GAP-43表達(dá)降低，而miR-204抑制劑處理后GAP-43的表達(dá)顯著增加；注射miR-204模擬物的大鼠和模型組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率明顯升高，且miR-204抑制劑可有效逆轉(zhuǎn)模型組的凋亡率，說(shuō)明miR-204通過(guò)抑制GAP-43促進(jìn)視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡[43]。

3.4 miR-204與角膜損傷miRNA在角膜發(fā)育中起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。An等[44]建立了一個(gè)影響創(chuàng)面愈合結(jié)局的miRNA基因網(wǎng)絡(luò)，并證實(shí)該網(wǎng)絡(luò)通過(guò)miR-204的差異表達(dá)來(lái)調(diào)控。在角膜傷口愈合過(guò)程中，miR-204的表達(dá)下調(diào)幅度最大。miR-204轉(zhuǎn)染的人角膜上皮細(xì)胞增殖明顯下降并誘導(dǎo)細(xì)胞周期G1停滯。Gao等[45]研究發(fā)現(xiàn)，miR-204-5p在糖尿病患者的角膜上皮中比非糖尿病患者的角膜上皮增加了近5倍，且SIRT1蛋白是miR-204-5p的直接靶點(diǎn)。在高糖條件下，通過(guò)調(diào)控Cyclin D1和p16可以下調(diào)miR-204-5p來(lái)增加小鼠角膜上皮細(xì)胞系(TKE2)生長(zhǎng)，恢復(fù)細(xì)胞周期進(jìn)程。下調(diào)miR-204-5p可使1型糖尿病模型Ins2(Akita)小鼠SIRT1表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)角膜上皮創(chuàng)傷愈合。miR-204-5p對(duì)SIRT1的調(diào)控可促進(jìn)糖尿病性角膜病變上皮細(xì)胞周期循環(huán)。miRNA的下調(diào)還可促進(jìn)人類(lèi)角膜上皮細(xì)胞的增殖和遷移，說(shuō)明其在角膜損傷愈合過(guò)程中具有重要作用。

3.5 miR-204與角膜新生血管角膜新生血管(CNV)會(huì)導(dǎo)致視力喪失。Kather等[46]研究顯示，在KLEIP基因敲除的小鼠角膜營(yíng)養(yǎng)不良模型中，血管生成素1(Ang-1)表達(dá)增加，而miR-204表達(dá)減少，致使CNV形成。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-204的表達(dá)缺失調(diào)控Ang-1使其表達(dá)上調(diào)，因此，miR-204是一種新的Ang-1的調(diào)節(jié)因子。Zhang等[47]研究發(fā)現(xiàn)，上皮細(xì)胞來(lái)源的miR-204可通過(guò)調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及其受體的表達(dá)來(lái)抑制縫線(xiàn)法誘導(dǎo)的小鼠角膜新生血管。miR-204主要在上皮細(xì)胞表達(dá)，而在有新生血管的角膜中表達(dá)下調(diào)。在小鼠結(jié)膜下注射miR-204激動(dòng)劑可以抑制CNV，降低VEGF和VEGF受體2的表達(dá)。同樣，miR-204過(guò)表達(dá)減弱了VEGF在角膜緣上皮細(xì)胞(LECs)中的表達(dá)，抑制了人微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HMECs)的增殖、遷移和CNV形成。Lu等[48]發(fā)現(xiàn)在堿燒傷小鼠CNV模型中，重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載體轉(zhuǎn)染miR-204后，可使CNV的多種靶基因和通路的表達(dá)趨于正常，從而減輕CNV。miR-204作為CNV的內(nèi)源性抑制基因，是抑制CNV形成的潛在治療靶點(diǎn)。

3.6 TRPM3與視網(wǎng)膜疾病TRPM3通道存在于整個(gè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，同時(shí)也是神經(jīng)甾體類(lèi)藥物硫酸孕烯醇酮(PregS)的受體。Webster等[49]發(fā)現(xiàn)，在發(fā)育中的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(RGCs)中，PregS可導(dǎo)致TRPM3通道產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)間的鈣瞬變，并增加RGCs自發(fā)性突觸電流的頻率；而在TRPM3基因敲除的小鼠視網(wǎng)膜中，未發(fā)現(xiàn)PregS介導(dǎo)的自發(fā)突觸電活動(dòng)增加，證明TRPM3和內(nèi)源性神經(jīng)類(lèi)固醇在視網(wǎng)膜發(fā)育過(guò)程中調(diào)節(jié)自發(fā)性突觸電活動(dòng)。Brown等[50]提出，在視網(wǎng)膜中，TRP家族的兩種基因TRPM1和TRPM3呈高表達(dá)，而TRPM3在內(nèi)叢狀層(IPL)、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層(GCL)表達(dá)。應(yīng)用TRPM3激動(dòng)劑PregS可激活小鼠RGCs中TRPM3依賴(lài)性鈣信號(hào)通路。促炎細(xì)胞因子可能導(dǎo)致與ARMD有關(guān)的RPE細(xì)胞發(fā)生功能障礙，Kutty等[51]發(fā)現(xiàn)在ARPE-19細(xì)胞中，MITF、TRPM1和TRPM3基因以及miR-204和miR-211的表達(dá)減少會(huì)導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子、趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)增加，認(rèn)為這些基因可以調(diào)節(jié)RPE細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。Hughes等[52]研究表明TRPM1和TRPM3在缺乏視桿細(xì)胞和視錐細(xì)胞的小鼠眼中都受到光的調(diào)控，無(wú)論是TRPM1缺失還是TRPM3缺失的小鼠，瞳孔光反應(yīng)都明顯減弱。TRPM3還在視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞和睫狀體中表達(dá)，而在感光性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中無(wú)表達(dá)，因此TRPM3在瞳孔光反應(yīng)中起到間接作用。

3.7 TRPM3與視神經(jīng)疾病鈣離子信號(hào)通路的激活是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)多種細(xì)胞外刺激的普遍反應(yīng)。Papanikolaou等[53]通過(guò)小鼠視神經(jīng)切片和培養(yǎng)物的免疫標(biāo)記證實(shí)，TRPM3通過(guò)鈣庫(kù)操縱性鈣內(nèi)流(SOCE)來(lái)補(bǔ)充內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣離子的存儲(chǔ)，并在小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果證明TRPM3是鈣通道的重要組成部分之一，支撐SOCE和ATP介導(dǎo)的鈣離子信號(hào)通道正常且持續(xù)發(fā)揮作用。

4小結(jié)

TRPM3/miR-204復(fù)合位點(diǎn)與年齡相關(guān)性白內(nèi)障、青光眼、ARMD等眼部疾病的發(fā)病存在顯著聯(lián)系，其在眼的發(fā)育、眼部疾病的發(fā)生發(fā)展及治療中更是發(fā)揮著重要作用。在許多已知TRPM3蛋白表達(dá)的組織中，有些通道目前還沒(méi)有明確其功能作用，未來(lái)對(duì)TRPM3通道的研究有望在新層面揭示其新功能。隨著生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及對(duì)眼部疾病病變機(jī)制的不斷研究，進(jìn)一步了解不同眼部疾病特定的TRP通道/miRNA分子通路調(diào)控靶基因、調(diào)節(jié)相關(guān)因子表達(dá)、影響信號(hào)通路的作用機(jī)制，從基因水平為預(yù)防和治療眼科疾病開(kāi)辟新前景十分重要。