miR-765通過調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展

龍石峰　龍生平　賀紅蕾

摘要：目的：探討miR-765對(duì)線粒體自噬發(fā)生的調(diào)控關(guān)系，以及對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展的影響。方法：通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RFQ-PCR）及蛋白質(zhì)印跡western bot試驗(yàn)技術(shù)測定靶基因及靶自噬關(guān)鍵蛋白的準(zhǔn)確含量。結(jié)果：多發(fā)性骨髓瘤患者化療前miR-765及自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平變化均顯著高于正常對(duì)照（P<0.05），miR-765和自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平變化具有正相關(guān)性。結(jié)論：miR-765可以調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生，而通過調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生進(jìn)一步影響多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生和發(fā)展。

關(guān)鍵詞：線粒體自噬;多發(fā)性骨髓瘤;蛋白質(zhì)印跡試驗(yàn)western bot

【中圖分類號(hào)】R730.4???????????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A???????????? 【文章編號(hào)】2107-2306（2021）12--02

引言

多發(fā)性骨髓瘤是一種以骨髓漿細(xì)胞惡性克隆性增殖為特征的B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤，與骨髓基質(zhì)細(xì)胞密切相關(guān)?-?。其自分泌或旁分泌可溶性細(xì)胞，這些細(xì)胞分泌細(xì)胞因子調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展?-??。細(xì)胞因子中即包括miR-765蛋白，其為TNF家族新成員，因具有促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖作用而命名，為幼稚、原始及活化B淋巴細(xì)胞的主要調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展因子之一。

Western Blot它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)方法?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因在蛋白水平的表達(dá)研究、抗體活性檢測和疾病早期診斷等多個(gè)方面。

在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞受外源性調(diào)控線粒體自噬激活的各種信號(hào)途徑中，NF-кB 途徑可能是最主要的途徑之一。目前研究已證實(shí)，能直接激活NF-кB途徑的miR-765，已經(jīng)被確認(rèn)是多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的主要存活調(diào)控線粒體自噬的發(fā)展發(fā)生促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生因子及生長調(diào)控線粒體自噬的發(fā)展發(fā)生促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生因子，骨髓瘤細(xì)胞系及幼稚骨髓瘤細(xì)胞高表達(dá)miR-765。miR-765被發(fā)現(xiàn)具有保護(hù)多發(fā)性骨髓瘤、B-CLL細(xì)胞避免自發(fā)性凋亡及藥物誘導(dǎo)性凋亡作用，同時(shí)可提高其細(xì)胞存活能力。故目前認(rèn)為，對(duì)miR-765的研究極有可能成為腫瘤，尤其是B淋巴細(xì)胞惡性腫瘤研究的新方向。

本研究采用RFQ-PCR及western bot試驗(yàn)技術(shù)，測定不同分期多發(fā)性骨髓瘤首次就診及應(yīng)用一周期VAD方案化療后患者外周血血漿中自噬關(guān)鍵蛋白及單個(gè)核細(xì)胞中miR-765的表達(dá)發(fā)展情況，并歸納總結(jié)miR-765表達(dá)發(fā)展與多發(fā)性骨髓瘤不同分期及化療前后間的關(guān)系，以期在多發(fā)性骨髓瘤早期診斷、早期治療、預(yù)測疾病活動(dòng)以及尋找預(yù)后生物參數(shù)等方面發(fā)揮重要作用，并為臨床治療新方法提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

62份標(biāo)本均取自井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院血液科2020年4月～2021年5月住院的31例初診及一周期VAD方案化療后患者外周血。其中男22例， 女9例，中位年齡65歲（46～82歲）。多發(fā)性骨髓瘤 Ⅰ期6例，Ⅱ期9期，Ⅲ期16例，其中A組12例，B組19例。15份健康供者標(biāo)本，中位年齡69歲（55～80歲）。多發(fā)性骨髓瘤分型、療效標(biāo)準(zhǔn)及疾病診斷采用《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》，由張之南主編。多發(fā)性骨髓瘤分期按國際分期系統(tǒng)（ISS）進(jìn)行。

1.2 western bot（蛋白質(zhì)印跡法）材料

限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶; pGEM-T載體試劑盒;Trizol 試劑;X-gal、Taq DNA聚合酶;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen公司）;DL-2000;膠回收試劑盒;ELISA試劑盒、自噬關(guān)鍵蛋白紫外分析儀、熒光定量PCR儀、全自動(dòng)酶標(biāo)儀。

1.3 western bot試驗(yàn)（蛋白質(zhì)印跡法）

1.3.1制備標(biāo)本

取化療前及后患者外周血6 mL，應(yīng)用EDTA抗凝， 2 mL提取血漿，4 mL分離出單個(gè)核細(xì)胞。

1.3.2設(shè)計(jì)探針及引物

據(jù)注冊(cè)號(hào)為NM012512的自噬關(guān)鍵蛋白（Pink1，parkin NIX） 全序列（內(nèi)參）和miR-765 （注冊(cè)號(hào)為AF04688 ），設(shè)計(jì)相應(yīng)引物和熒光探針并合成。

1.3.3 構(gòu)建調(diào)控線粒體自噬基因（miR-765）及內(nèi)參β-ACTIN及自噬關(guān)鍵蛋白（Pink1，parkin NIX）標(biāo)準(zhǔn)品

細(xì)胞總RNA經(jīng)Trizol法提取后檢測其濃度和純度，并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)， cDNA進(jìn)行擴(kuò)增目的片段，膠回收電泳PCR產(chǎn)物與T載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)過藍(lán)白斑western bot試驗(yàn)篩選出重組質(zhì)粒，提取出小量，陽性克隆經(jīng)EcoRⅠ酶切western bot試驗(yàn)鑒定、測序分析證實(shí)后進(jìn)一步擴(kuò)增，質(zhì)粒抽提，再經(jīng)自噬關(guān)鍵蛋白紫外分析儀定量，按倍比稀釋后保存。

1.3.4 RFQ-PCR檢測miR-765含量

在離心管中加入反應(yīng)體系，并設(shè)5個(gè)miR-765標(biāo)準(zhǔn)品、空白管及陰性管各3個(gè)復(fù)孔作為對(duì)照。PCR 擴(kuò)增在熒光定量檢測儀中進(jìn)行。由電腦軟件計(jì)算出標(biāo)本中miR-765值， 將miR-765與Pink1，parkin NIX比值定為評(píng)估m(xù)iR-765表達(dá)水平變化的標(biāo)值。

1.3.5? western bot方法檢測自噬關(guān)鍵蛋白含量

western bot方法檢測自噬關(guān)鍵蛋白（Pink1，parkin NIX）含量，嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行，測定靶自噬關(guān)鍵蛋白含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Stata7.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，正常對(duì)照及多發(fā)性骨髓瘤患者化療前不同分期、多發(fā)性骨髓瘤患者化療后不同療效miR-765和自噬關(guān)鍵蛋白的表達(dá)發(fā)展比較均采用單因素方差分析，如差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)實(shí)際實(shí)踐的價(jià)值，進(jìn)一步兩兩比較采用Scheffe法，P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的純度和質(zhì)量

細(xì)胞總RNA檢測表明，提示質(zhì)量及完整性均良好。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測， 結(jié)果表明片段大小符合預(yù)期值。

2.3 western bot試驗(yàn)鑒定陽性克隆

將藍(lán)白斑western bot試驗(yàn)篩選出的重組質(zhì)粒， 抽提出小量，EcoRⅠ內(nèi)切酶，western bot試驗(yàn)鑒定陽性克隆后測序分析，顯示與Pink1，parkin NIX及miR-765的基因序列相符，同源性達(dá)100%。

2.4 ELISA檢測的線性關(guān)系

miR-765標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)酶標(biāo)儀測定OD值，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度與相應(yīng)OD值之間存在良好的線性相關(guān)（r=1%）。

2.5 基因miR-765通過調(diào)控線粒體自噬及自噬關(guān)鍵蛋白測定結(jié)果

結(jié)果表明：對(duì)照組與多發(fā)性骨髓瘤患者化療前各期miR-765及自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)發(fā)展均采用單因素方差分析比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（miR-765 F=4.28，P=0.0275; miR-765自噬關(guān)鍵蛋白F=5.11，P=0.0157），Scheffe法進(jìn)一步兩兩比較顯示：各期miR-765及自噬關(guān)鍵蛋白水平均顯著高于正常對(duì)照（P<0.05）

3 討論

在過去的幾年中，努力尋找識(shí)別多發(fā)性骨髓瘤高危人群的預(yù)后指標(biāo)及明確促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞惡性增殖及耐藥發(fā)生的一系列復(fù)雜機(jī)制的研究已大量開展，最近研究顯示，miR-765在B細(xì)胞的生成、免疫耐受及惡性克隆性增殖等方面均發(fā)揮重要作用。在正常生理狀態(tài)下，miR-765是骨髓中漿細(xì)胞不可缺少的調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)展發(fā)生因子。研究顯示，分泌大量miR-765的巨核細(xì)胞，對(duì)漿細(xì)胞而言是必不可少的骨髓組成部分，間接表明漿細(xì)胞存活有賴于miR-765。這些選擇性局灶性分泌的miR-765可能對(duì)骨髓中淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤的存活起至關(guān)重要的作用。多項(xiàng)研究已證實(shí)miR-765在腫瘤疾病中發(fā)揮重要作用，尤其是B細(xì)胞惡性腫瘤。人miR-765 轉(zhuǎn)染的小鼠，大約40%最終發(fā)展為類似于B-CLL的B細(xì)胞惡性腫瘤。

在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，多發(fā)性骨髓瘤患者miR-765血清自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平變化明顯高于正常對(duì)照，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，且miR-765表達(dá)發(fā)展與自噬關(guān)鍵蛋白水平表達(dá)發(fā)展一致。更重要的是，我們證實(shí)，多發(fā)性骨髓瘤分期越高，其miR-765及自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)表達(dá)水平變化越高，Ⅲ期明顯高于Ⅰ期及Ⅱ期，化療后表達(dá)表達(dá)水平變化下降，與文獻(xiàn)報(bào)道相一致，具體數(shù)據(jù)另篇論文詳細(xì)敘述。我們進(jìn)一步將化療后不同療效進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，PD組顯著高于CR及PR組（P<0.05）。

主要數(shù)據(jù)分析表明，miR756的表達(dá)水平的變化和線粒體自噬蛋白水平變化有明顯相關(guān)性，miR756能調(diào)控線粒體自噬，通過調(diào)控線粒體自噬影響多發(fā)性骨髓的發(fā)生和發(fā)展，分析與研究體現(xiàn)miR756，自噬，多發(fā)性骨髓瘤三者間的關(guān)系。

在本研究中，患者中 血清 miR-765表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組，且ISS分期Ⅲ期患者顯著低于I/Ⅱ期患者（P<0.05），此外 miR-765的表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤的髓外浸潤相關(guān)?[10]（P<0.05）。miR-765位于人類染色體17pl31，在幾乎所有人體器官和組織中均有表達(dá). 例如大腦、乳腺、肺、胃和血液等?。目前已有大量的研究指出 miR-765 在多種腫瘤類型中的處于失常的狀態(tài)，從而促進(jìn)腫瘤疾病進(jìn)程發(fā)展?。例如，Han等人發(fā)現(xiàn)，在 ERα陰性乳腺癌中，miR-765的表達(dá)量降低通過增加的 MIF表達(dá)和增強(qiáng) 患者P9 活性，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。Zhang 等1n報(bào)道，miR-765通過直接靶向 E2F3基因抑制人膀胱癌移行細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。Ge 等報(bào)道，在骨肉瘤細(xì)胞中miR-765過表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖，克隆形成，遷移和侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯。并且在裸鼠模型中miR-765的過表達(dá)能夠抑刺腫瘤生長。提示miR-765與腫瘤患者疾病進(jìn)程顯著相關(guān)，可能可以用于腫瘤患者的診斷或早期診斷。

圖2 miR-765表達(dá)水平與無事件生存期之間的關(guān)系

ROC曲線分析結(jié)果指出，miR-765 的表達(dá)含量對(duì) 患者 患者和對(duì)照組的簽別能力良好，miR-765的曲線下面積（AUC）為0.9333，觸感性為86%，特異性為96%，95%置信區(qū)間（CI）0. 886-0.981∶P<0.0017。此外，20個(gè)月的隨訪指出，miR-765低表達(dá)組的無事件生存期顯著高于miR-765 高表達(dá)組。指出 血清中 miR-765的表達(dá)水平與患者的預(yù)后相關(guān)?？傊?，本研究表明血清中 miR-765 的表達(dá)水平可用作生物標(biāo)志物幫助 患者中的診斷和預(yù)測。miR-765 可用于鑒定預(yù)后不良的患者，有助于及時(shí)選擇合適的治療方案。

結(jié)論：

綜上所述，我們的結(jié)果已顯示，miR-765及自噬關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平是提示多發(fā)性骨髓瘤疾病發(fā)生和進(jìn)展的有重要意義的生物學(xué)指標(biāo)。miR-765表達(dá)水平變化是調(diào)控線粒體自噬的發(fā)生促進(jìn)多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生發(fā)展的重要因素。miR-765水平檢測可以作為多發(fā)性骨髓瘤的診斷、早期治療及預(yù)后的新指標(biāo)，且可能成為有效治療的新靶點(diǎn)。

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作者簡介：第一作者，姓名：龍石峰，職稱：副主任醫(yī)師 科室：血液科，出生年月：1975-11-20，井岡山大學(xué)附屬醫(yī)院343000。