河南省部分城市寵物犬芽囊原蟲的感染情況調(diào)查

陳 益 ， 賀桂芬 ， 夏艷勛 ， 王海燕 ， 裴雅琦

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院 ， 河南 鄭州 450046)

芽囊原蟲是一種常見的、可引起動物和人腹瀉的胃腸道寄生性原蟲。宿主范圍廣泛，包括人類、非人靈長類動物、伴侶動物、反芻動物、鳥類和野生哺乳動物[1]。芽囊原蟲可通過直接接觸或吃入受污染的水和食物感染，通過糞-口傳播方式進行傳播[2]。芽囊原蟲常與胃腸道疾病有關(guān)，例如自限性腹瀉、腹痛、腸應(yīng)激綜合征、脹氣和蕁麻疹[3-4]。犬是與人類密切接觸的伴侶動物，最可能成為人類芽囊原蟲感染的潛在傳染源。世界各地均有人、犬同時檢出相同芽囊原蟲亞型的報道，如在澳大利亞，人與犬共同感染ST1、ST3和ST4亞型 ； 在菲律賓，人、犬同感染ST1～ST5亞型； 在土耳其，人、犬同感染ST1～ST3亞型[5-6]。這些研究表明，犬可能是芽囊原蟲的保蟲宿主，在其傳播給人類的途徑中起著重要的作用。目前，關(guān)于中國犬芽囊原蟲感染情況和STs亞型分布信息較少[7]，因此，本試驗旨在調(diào)查河南部分城市犬芽囊原蟲的感染情況及亞型分布特征，為評估其人獸共患性及公共衛(wèi)生學意義提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2018年11月—2019年4月，分別從鄭州、洛陽、開封、新鄉(xiāng)、焦作5個地區(qū)動物醫(yī)院采集236份寵物犬新鮮糞便，詳細來源見表1。糞樣分裝于自封袋中，標注犬地區(qū)、年齡、采集時間等相關(guān)信息，置放有冰袋的泡沫盒中運輸，然后置4 ℃冰箱中待檢。

表1 犬糞便樣品信息Talbe 1 Information of canine fecal sample

1.2 主要試劑 基因組E.Z.N.A.?Stool DNA Kit(OMEGA Biotek Inc.,Norcross,USA)；TaKaRaTaq、瓊脂糖、6×Loading Buffer、DNA marker DL-2 000[寶生物工程(大連)有限公司]；GelRedTM核酸染料(Biotium Inc.,Hayward，CA)；其他常用試劑。

1.3 主要儀器 超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)；Arktik 型PCR(Techgene，英國)；微量移液器、Alphalmager HP型紫外凝膠成像系統(tǒng)(Thermo公司，美國)；HH-2恒溫水浴鍋(常州華奧器械公司)；LDZX型高壓滅菌器、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進醫(yī)用器械廠)；SHA-C數(shù)顯恒溫振蕩水浴鍋(金壇恒豐器械廠)；DYCZ-Ш28A型電泳槽；DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)；高速離心機(Eppendorf，德國)；低速冷凍離心機(上海安亭儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 糞便基因組DNA提取 取200～300 mg新鮮糞便樣品置1.5 mL離心管中，加入1 mL滅菌蒸餾水，3 500 r/min離心10 min，反復洗滌3次，直至上清無色透明。之后按試劑盒(OmegaBio-tek)說明書操作，將提取的DNA置-20 ℃冰箱保存。

1.4.2 犬芽囊原蟲小亞單位核糖體核糖核酸(SSU rRNA)基因擴增 按照Scicluna等[8]設(shè)計引物，F(xiàn)-RD5:5′-ATCTGGTTGATCCTGCCAGT-3′，R-RD3:5′-GAGCTTTTTAACTGCAACAACG-3′，預計產(chǎn)物片段為520 bp。每組PCR反應(yīng)均設(shè)陽性對照(奶牛芽囊原蟲分離株)、陰性對照(蒸餾水)。配制25 μL體系：雙蒸水19.05 μL，10×Ex-TaqBuffer 2.5 μL，dNTPs(10 mmol/ L) 0.5 μL，上游引物(RD5) 0.4 μL，下游引物(RD3)0.4 μL，ExTaq酶(5 U/μL) 0.15 μL，模板DNA 2 μL。犬芽囊原蟲SSU rRNA基因擴增程序：94 ℃預變性7 min；93 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，反應(yīng)35個 循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；4 ℃保存。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳檢測及序列測定、分析 取PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外凝膠成像儀下觀察。將陽性產(chǎn)物送北京諾賽公司進行雙向測序，用Clustal X 2.3.3將反向測序得到的序列反轉(zhuǎn)互補后與正向測序序列進行手動比對截齊，獲得校正序列，將校準后的序列在NCBI的BLAST上進行檢索(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)，確定序列是否為芽囊原蟲基因序列。

1.4.4 種系發(fā)育系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建 基于MEGA 7.0(http://www.megasoftware.net)軟件，采用鄰接(Neighbor joining, NJ)法(自展值為1 000、Kimura-2參數(shù)模型)，基于SSU rRNA基因位點構(gòu)建種系發(fā)育系統(tǒng)進化樹。

2 結(jié)果

2.1 感染情況 236 份寵物犬糞樣基因組DNA 擴增后，5份樣品在500～750 bp出現(xiàn)特異條帶，與預期片段大小相符(圖1)，總感染率為2.1%(5/236)。其中洛陽市、鄭州市和焦作市的寵物犬中檢出芽囊原蟲，感染率分別為2.1%(1/48)、3.0%(2/67)和3.4%(2/59)，開封和新鄉(xiāng)兩地未檢出(表2)。

圖1 犬糞便中芽囊原蟲SSU rRNA基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of Blastocystis SSU rRNA gene in canine fecesM：DNA標準DL-2 000； 1：陰性對照； 2：陽性對照； 3～7：糞便樣品M:DL-2 000 DNA marker; 1:Negative control; 2:Positive control; 3-7:Faecal samples

將寵物犬分為不同的年齡組，≤6月齡犬(n=129)和>6月齡犬(n=107)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，寵物犬芽囊原蟲陽性樣品均來自6月齡以下的犬，感染率為3.8%(5/129)，6月齡以上的犬未見感染。見表2。

表2 各地犬芽囊原蟲檢出情況統(tǒng)計Table 2 Statistics of canine Blastocystis detection in some cities of Henan

2.2 亞型分布情況 基因公司測序校正后獲得2個不同的序列，序列1(命名為Henan-dog-1，n=1)和序列2(命名為Henan-dog-2，n=4)，比對發(fā)現(xiàn)2個序列分別與英國山羊源分離株(序列號:MF186699)和中國人源(序列號:MK898940)分離株同源性100%。

基于SSU rRNA基因進行的種系發(fā)育系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，2個不同的基因序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中芽囊原蟲ST1亞型位于同一進化支上，見圖2。研究結(jié)果表明，該地區(qū)寵物犬共檢測到1種芽囊原蟲基因型，為ST1亞型。

圖2 基于SSU rRNA基因位點的芽囊原蟲亞型鄰接法(NJ)系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree with neighbor joining (NJ) subtype based on SSU rRNA gene of Blastocystis▲: 本試驗所得序列▲: Sequences in the present study

3 討論

世界各地范圍內(nèi)都有犬芽囊原蟲感染的報道,如美國太平洋西北部流浪犬的感染率為9.7%(10/103)[9]，菲律賓一城市社區(qū)寵物犬的感染率為15.8%(23/145)[10]，澳大利亞寵物犬的感染率為2.5%(2/80)，哥倫比亞半家養(yǎng)犬的感染率為1.3%(1/80)，印度流浪犬的感染率為24%(19/80)[11]，巴西家養(yǎng)犬的感染率為2.6%(2/78)[12]，法國家養(yǎng)犬的感染率為3.4%(4/116)[13]，而哥倫比亞家養(yǎng)犬的感染率高達37.5%(15/40)[14]。我國關(guān)于犬芽囊原蟲感染報告較少，只有中國東北地區(qū)(黑龍江、吉林和遼寧)家養(yǎng)犬的感染率為2.9%[7]，安徽滁州、合肥犬感染率分別為3.4%和5.6%[15]。本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)，河南部分城市寵物犬芽囊原蟲感染率為2.1%，低于上述報道。造成芽囊原蟲感染差異性的因素很多，包括不同的樣本量、犬生活的衛(wèi)生條件、檢測方法、季節(jié)、年齡和地理環(huán)境等。

基于小亞單位核糖體核糖核酸(SSU rRNA)基因的系統(tǒng)進化分析，芽囊原蟲存在廣泛的基因內(nèi)變異，目前，已檢測出17個不同的亞型(STs)[16]。其中ST1～ST9和ST12在人類中發(fā)現(xiàn)，以ST3為主，其次為ST1[17]，而ST10、ST11和ST13～ST17只感染動物[18]。然而，在動物體內(nèi)不斷發(fā)現(xiàn)可感染人類的基因亞型，如在靈長類(ST1)、豬(ST1、ST3、ST5)、猴(ST2)、犬(ST1～ST4、ST6)、牛(ST4、ST6)、羊(ST5)、牛(ST6)以及鳥(ST7)[19-23 ]。此外，一些研究表明，人類與接觸動物之間存在高度相似甚至完全相同的基因亞型，這提示了芽囊原蟲的人獸共患性[21,24-25]。最近的研究表明，芽囊原蟲不同的基因亞型可能有不同的致病性，例如ST1和 ST3常在有癥狀的患者中出現(xiàn)，更有可能對人類具有致病性，其余STs亞型可能對人類無明顯致病性。本次從236份寵物犬糞便中檢出5份ST1亞型，表明河南省部分地區(qū)存在芽囊原蟲人—犬共患風險，具有重要的公共衛(wèi)生學意義。