侵襲性肺曲霉菌感染實(shí)驗(yàn)診斷新進(jìn)展

高東田， 劉利華， 申愛華， 孫 寅

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)寧 272029）

侵襲性肺曲霉菌感染（invasive pulmonaryAspergillusinfection，IPAI）是多發(fā)生于有免疫缺陷患者的全身感染性疾病。近年來，隨著慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmonary disease，COPD）和腫瘤發(fā)病率的持續(xù)上升，器官移植和各種導(dǎo)管侵入性操作的廣泛開展，免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素和抗腫瘤藥物的普遍使用，IPAI呈上升趨勢。IPAI較難診治，患者病死率為55%～80%[1]，已引起臨床的高度重視。IPAI往往因其癥狀輕微或缺乏特異性臨床表現(xiàn)，且常與細(xì)菌性肺炎相混淆，很容易被漏診和誤診。早期準(zhǔn)確診斷和快速進(jìn)行初始治療，對改善患者預(yù)后、降低病死率有重要意義。探索IPAI診斷新技術(shù)已成為目前臨床IPAI診斷的關(guān)注點(diǎn)。本文就IPAI實(shí)驗(yàn)診斷新進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 組織病理學(xué)

組織病理學(xué)是IPAI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，采用免疫組織化學(xué)（簡稱免疫組化）方法，用標(biāo)記的抗體或抗原對細(xì)胞或組織中的相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行定性、定位或定量檢測，通過顯色反應(yīng)和顯微鏡進(jìn)行觀察。由于抗原、抗體的相對特異性和敏感性較高，可以做出相對特異性的診斷，常采用蘇木精-伊紅染色、嗜銀染色、熒光染色等特殊染色；如見到隔菌絲和分生孢子頭，即可判斷曲霉菌感染。國外已制備出鼠抗煙曲霉單克隆抗體，一旦在臨床樣本和/或組織切片中發(fā)現(xiàn)曲霉菌菌絲和/或孢子，結(jié)合常用的曲霉菌染色和免疫組化特異抗體染色，即可對臨床常見條件致病曲霉菌做出特異性診斷。馬蕾等[2]采用免疫組化二步法對34例深部真菌病患者的臨床樣本用福爾馬林固定，對石蠟包埋切片進(jìn)行糖原染色和免疫組化標(biāo)記，結(jié)果顯示16例免疫組化染色為可疑曲霉菌感染的患者中有14例陽性，且菌體染色清晰、無背景（陽性率為87.5%）。證實(shí)了免疫組化二步法應(yīng)用于深部曲霉菌感染檢測具有高敏感、低背景和快速、簡便的特點(diǎn)，在曲霉菌感染的臨床病理學(xué)診斷中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。雖然病理樣本經(jīng)糖原或熒光染色有助于檢測到曲霉菌特征性分支結(jié)構(gòu)，但組織病理學(xué)檢測為侵入性操作，且不能判斷曲霉菌種類，如重癥監(jiān)護(hù)病房患者往往由于凝血功能障礙或存在急性呼吸窘迫綜合征等肺活檢的禁忌癥，很難獲得感染部位的病理學(xué)依據(jù)；另外，免疫組化檢測成本高，抗體制備難，還可能出現(xiàn)假陽性或假陰性結(jié)果。

2 病原學(xué)

2.1 涂片鏡檢

對于痰液或支氣管肺胞灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）等臨床樣本，涂片鏡檢是最簡單、實(shí)用和直接的實(shí)驗(yàn)室診斷方法，也是最經(jīng)典的檢測方法之一。鏡下查見45°分支分隔、粗細(xì)均勻的曲霉菌絲，菌絲反復(fù)分支呈放射狀，偶見分生孢子，即可初步診斷為曲霉菌。痰液樣本涂片鏡檢陽性率低，且易受污染，取自無菌部位的BALF涂片鏡檢的診斷價(jià)值較大，有研究發(fā)現(xiàn)，涂片鏡檢進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的特殊染色可提高陽性率[3]；有文獻(xiàn)報(bào)道高?；颊咴\療期間平均反復(fù)行痰涂片鏡檢真菌3.5次時(shí)，檢測敏感性為87.7%、特異性為72.1%[4]。雖然臨床樣本直接鏡檢可見真菌寄生情況，可擬診斷為肺曲霉菌感染，但需注意的是鏡下曲霉菌菌絲常與鐮刀菌及足放線菌混淆，有時(shí)鏡檢陰性并不能排除活動性感染。

2.2 培養(yǎng)

IPAI可常規(guī)采用無菌肺部組織、血液和呼吸道分泌物樣本（BALF和痰液）進(jìn)行曲霉菌培養(yǎng)，其中肺部組織和BALF曲霉菌培養(yǎng)是診斷IPAI的金標(biāo)準(zhǔn)，陽性結(jié)果診斷價(jià)值較大，但耗時(shí)較長，且陽性率低，一定程度上限制了其早期診斷價(jià)值。司淑一[5]報(bào)道了不同臨床樣本培養(yǎng)陽性率：痰液為12%、BALF為40%～50%、血液為＜5%。當(dāng)從痰液樣本中培養(yǎng)出曲霉菌時(shí)，還需要判斷是感染還是定植。歐洲癌癥及真菌感染防治組織制定的IPAI判斷標(biāo)準(zhǔn)僅針對免疫缺陷患者，而在重癥監(jiān)護(hù)病房，IPAI往往可見于沒有曲霉菌感染的高危因素、缺乏典型癥狀及感染生物標(biāo)志物陰性的病例，這種情況可采用無菌裝置吸取氣道分泌物進(jìn)行曲霉菌培養(yǎng)，一項(xiàng)包括524家醫(yī)療機(jī)構(gòu)重癥監(jiān)護(hù)病房的多中心觀察性研究結(jié)果顯示其敏感性較高（92%），并能更好地區(qū)分定植和感染[6]，值得推廣應(yīng)用。然而，IPAI患者呼吸道樣本培養(yǎng)陽性率僅為61%[6]。除土霉菌外，血培養(yǎng)分離到曲霉菌往往被認(rèn)為是污染，而非感染樣本，常規(guī)的血培養(yǎng)很難診斷IPAI。因此，傳統(tǒng)的曲霉菌培養(yǎng)對于分離和依據(jù)曲霉菌菌落形態(tài)及微觀特性鑒別其種類至關(guān)重要。值得注意的是，培養(yǎng)陰性并不能排除活動性感染。

3 分子生物學(xué)

目前，診斷IPAI的分子生物學(xué)技術(shù)主要為曲霉菌核酸檢測和聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）。

3.1 核酸檢測

近年來，采用曲霉菌通用引物對待檢樣本進(jìn)行擴(kuò)增，在短時(shí)間內(nèi)檢測微量的曲霉菌DNA；再采用屬或種特異性引物對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增，進(jìn)行分型和鑒定，通過對其18S、28SrDNA、 轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)、細(xì)胞色素P-450、14-α脫甲基酶、角鯊烯環(huán)氧化物酶等目的序列進(jìn)行分析，已設(shè)計(jì)出煙曲霉、孢子絲菌、皮炎外瓶霉和茄病鐮刀菌的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)種特異性引物用于IPAI診斷。目前的分子生物學(xué)方法有巢式PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、光譜PCR和DNA測序、多重PCR、微陣列、光譜PCR電噴霧質(zhì)譜技術(shù)、PCR-限制性片段長度多態(tài)性分析（restriction fragment length polymorphism，RFLP）技術(shù)、隨機(jī)引物擴(kuò)增DNA多態(tài)性（random amplified polymorphic DNA，RAPD）技術(shù)及基因芯片等，較大程度地增加了檢測的靈敏度與特異性，為鑒別曲霉菌定植、感染及種屬方面提供有益幫助。其中，巢式PCR采用全血/血漿定性檢測煙曲霉菌DNA片段，可早期檢出較低含量的曲霉菌，已被廣泛應(yīng)用。近年研究較多、最有前途的PCR技術(shù)是實(shí)時(shí)熒光定量PCR的LightCycler檢測系統(tǒng)，WITTWER等[7]發(fā)現(xiàn)瑞士Roche公司的Lightcycler熱循環(huán)儀將裝載容量為20～25 μL的毛細(xì)硅管作為反應(yīng)管進(jìn)行擴(kuò)增，光源選用冷光源系統(tǒng)，可以減少光源對樣本的影響，由二極管發(fā)射藍(lán)光激發(fā)熒光，并提供3個濾光片，可利用熒光分光測定的原理，同時(shí)對1個反應(yīng)體系的多種熒光進(jìn)行檢測，完全可以進(jìn)行多重PCR。這種LightCycler檢測系統(tǒng)采用獨(dú)特的毛細(xì)管反應(yīng)體系和空氣快速熱循環(huán)系統(tǒng)，使樣本能在非常短的時(shí)間內(nèi)有效地實(shí)現(xiàn)溫度變化，從而能在20～30 min內(nèi)快速完成30～40個循環(huán)，達(dá)到樣本擴(kuò)增的目的。PAIVA等[6]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測真菌病原體核酸，敏感性為88%、特異性為75%，如聯(lián)合檢測半乳甘露聚糖（galactomannan，GM），特異性可達(dá)97%，特別適用于已經(jīng)開始抗真菌治療的患者。值得注意的是，PCR的方法學(xué)、標(biāo)準(zhǔn)和試劑可靠性對IPAI檢測結(jié)果影響較大，不同方法的敏感性和特異性也有較大差異。因此，正確選擇試劑和方法以獲得良好的診斷符合率非常重要。朱利平等[8]推薦采用SeptiFast序列（瑞士Roche公司分子診斷工具）檢測曲霉菌DNA，以基因序列分析結(jié)果作為曲霉菌鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)，也可采用未經(jīng)福爾馬林固定的冷凍病理切片，或從活組織樣本中提取的DNA，進(jìn)行多種PCR分析。隨著技術(shù)的不斷完善，PCR有望成為更好的曲霉菌檢測方法。

3.2 基因探針技術(shù)

曲霉菌核糖體RNA的堿基序列由可變區(qū)和保守區(qū)組成，利用保守區(qū)可設(shè)計(jì)通用探針，利用可變區(qū)可設(shè)計(jì)針對不同菌種的特異性探針。WANG等[9]用99mTc標(biāo)記的探針靶向曲霉菌核糖體RNA，結(jié)合成像系統(tǒng)測序診斷IPAI，有望成為一種新方法。

4 IPAI相關(guān)生物標(biāo)志物（靶物質(zhì)）檢測

非培養(yǎng)的曲霉菌（IPAI相關(guān)生物標(biāo)志物）檢測技術(shù)具有快速、簡便、敏感性和特異性高的優(yōu)點(diǎn)，為臨床早期快速診斷IPAI、及時(shí)控制病情和評估預(yù)后具有重要意義。隨著新的、更先進(jìn)的GM試驗(yàn)及1，3-β-D-葡聚糖、穿透素-3（pentraxin-3，PTX-3）、細(xì)胞因子、醋酸鐮孢氨酸C（triacetylfusarinine C，TAFC）、二甲硫基膠霉素（bis-methylthio gliotoxin，bmGT）、曲霉菌特異性抗體、曲霉菌特異性揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compound，VOC）、D-甘露聚醇和鐵載體/鐵載體蛋白等生物標(biāo)志物檢測及特異性雙糖質(zhì)譜分析、免疫層析測流裝置技術(shù)（immunochromatographic lateral-flow device，LFD）的發(fā)展，IPAI相關(guān)生物標(biāo)志物檢測有望成為IPAI實(shí)驗(yàn)室診斷的重要方法，是非常有發(fā)展?jié)摿Φ腎PAI診斷新技術(shù)[10]。

4.1 GM試驗(yàn)

4.1.1 血清/肺泡灌洗液GM檢測 在曲霉菌侵襲組織早期，曲霉菌細(xì)胞壁外層的GM可被釋放入血，此抗原可持續(xù)1～8周，在癥狀和體征出現(xiàn)前即可反映機(jī)體曲霉菌感染。2003年，美國批準(zhǔn)GM試驗(yàn)用于血液病、腫瘤等免疫功能低下患者并發(fā)IPAI的診斷。臨床常用試劑為曲霉菌抗原檢測試劑盒，采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測GM，敏感性和特異性分別為86.3%和93.0%[1]，對IPAI的早期診斷和治療監(jiān)測更有價(jià)值，目前已被廣泛應(yīng)用。在高風(fēng)險(xiǎn)IPAI患兒的診斷中，GM試驗(yàn)敏感性為76%、特異性為86%，且對于血液病和造血干細(xì)胞移植患者更有診斷價(jià)值[11]。但是，有多種因素可能導(dǎo)致GM試驗(yàn)假陽性：（1）使用哌拉西林-他唑巴坦后，可能與交叉反應(yīng)有關(guān)；（2）其他侵襲性真菌（青霉菌、鐮刀菌、組織胞漿菌和球孢子菌）感染[11]；（3）服用其他抗真菌藥物（除大扶康外）會導(dǎo)致GM假陰性結(jié)果；（4）血液病、惡性腫瘤患者，尤其是接受造血干細(xì)胞移植（可能與免疫正常宿主對侵入血管的曲霉菌清除有關(guān)）的非中性粒細(xì)胞減少患者中，因中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)會降低或清除循環(huán)中的相應(yīng)抗原，血清GM水平幾乎對曲霉菌感染沒有診斷價(jià)值。相對于血清樣本，采用GM試驗(yàn)檢測BLAF樣本，敏感性和特異性會更高，分別為75.68%和80.72%[12]，BALF GM檢測對IPAI診斷意義較大。

4.1.2 尿液/腦脊液GM檢測 對血液和BALF之外的其他體液樣本，如尿液和腦脊液樣本進(jìn)行GM檢測，對輔助臨床診斷IPAI也可起到重要作用[13]。曲霉菌進(jìn)入肺組織后，或當(dāng)泌尿系統(tǒng)或全身性曲霉菌感染時(shí)，會釋放GM進(jìn)入肺組織、尿液和腦脊液。REISCHIES等[14]探討了尿GM/尿肌酐檢測診斷血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者IPAI的價(jià)值，結(jié)果顯示，當(dāng)臨界值為0.26時(shí)，檢測敏感性為79%、陰性預(yù)測值（negative predictive value，NPV）＞98%、陽性預(yù)測值（positive predictive value，PPV）13%，表明尿GM/尿肌酐檢測排除IPAI的價(jià)值較大，為IPAI的診斷提供了新思路。DUFRESNE等[15]采用免疫層析測流法和IgM單克隆抗體識別曲霉菌GM抗原，測定宿主尿液中的GM水平。我國關(guān)于尿GM/腦脊液GM檢測的報(bào)道較少，有研究報(bào)道72只大鼠的尿液GM試驗(yàn)中，共5例陽性，敏感性為13.89%、特異性為100%[16]。尿GM檢測敏感性低于血清GM檢測，且GM在尿中出現(xiàn)較晚，早期診斷價(jià)值小，對尿液的GM檢測影響因素包括GM動力學(xué)、腎臟清除率等，尿液GM檢測假陽性率較高，其技術(shù)有待進(jìn)一步改進(jìn)[17]。10%～20%的IPAI患者腦脊液GM水平升高，腦脊液GM檢測有助于早期診斷侵襲性中樞神經(jīng)系統(tǒng)曲霉菌感染。

4.2 G試驗(yàn)

G試驗(yàn)常被用于判斷IPAI的嚴(yán)重程度和療效觀察[18]。對血液或BLAF樣本進(jìn)行G試驗(yàn)，靈敏度可達(dá)1 ng/L，特異性也較高，分別為77.2%（血液樣本）和78.3%（BLAF樣本）[1]，但G試驗(yàn)陰性不能完全排除曲霉菌感染。與培養(yǎng)法相比，G試驗(yàn)所需時(shí)間較短且操作簡單。但G試驗(yàn)無法檢測隱球菌及接合菌感染，只能診斷真菌感染，無法確定真菌種類。有較多因素可致G試驗(yàn)假陽性：（1）正常人體定植的曲霉菌、白念珠菌等正常菌群及某些革蘭陰性桿菌也可釋放少量的1，3-β-D-葡聚糖入血；（2）某些藥物，如頭孢菌素類、氨芐西林-舒巴坦可影響檢測結(jié)果；（3）行纖維素膜、白蛋白、免疫球蛋白治療患者的樣本，紗布或其他醫(yī)療物品（外科手術(shù)）及某些細(xì)菌敗血癥等因素。G試驗(yàn)早期診斷IPAI意義不大，用于病情監(jiān)測和療效觀察效果較好。連續(xù)2次或以上與GM聯(lián)合檢測，對于早期診斷IPAI、提高陽性率有較高價(jià)值。

4.3 PTX-3檢測

PTX-3是參與炎癥急性期和免疫應(yīng)答反應(yīng)過程的保守蛋白中的一個亞家族，是Pentraxin家族（包括C反應(yīng)蛋白、血清蛋白A）中被新發(fā)現(xiàn)的蛋白，也是急性時(shí)相炎癥介質(zhì)，感染后數(shù)小時(shí)便可被檢出，屬于炎癥急性期反應(yīng)蛋白。血液PTX-3水平與感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展及病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的重要生物標(biāo)志物。有研究[19]發(fā)現(xiàn)，IPAI發(fā)生時(shí)，經(jīng)適當(dāng)刺激，肺部可產(chǎn)生PTX-3，血液中PTX-3水平會升高，對快速診斷曲霉菌感染有較高價(jià)值，而且可作為判斷病情嚴(yán)重程度和預(yù)后評估的指標(biāo)。采用雙抗體夾心ELISA對血清/血漿/BALF樣本進(jìn)行檢測，基于固相ELISA的原理，可以在3.5 h內(nèi)迅速檢測PTX-3水平。聯(lián)合應(yīng)用PTX-3、BALF GM試驗(yàn)或曲霉菌培養(yǎng)，可大大提高IPAI的診斷準(zhǔn)確性。

4.4 TAFC檢測

TAFC可介導(dǎo)感染過程中宿主鐵的獲取，是煙曲霉菌感染宿主后在轉(zhuǎn)運(yùn)鐵過程中產(chǎn)生的一種分泌型小分子螯合劑，是一種新型標(biāo)志物。ORASCH等[20]采用ELISA聯(lián)合檢測血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者BALF樣本中的GM和TAFC診斷IPAI，發(fā)現(xiàn)敏感性從單用GM試驗(yàn)的53%（以1.0為臨界值）、73%（以0.5為臨界值）分別提高到73%、87%，對于IPAI的確診及排除診斷均有意義。但此項(xiàng)生物標(biāo)志物的檢驗(yàn)效果仍需更多研究結(jié)果加以證實(shí)。

4.5 bmGT檢測

bmGT是曲霉菌膠霉素甲基化產(chǎn)生的一種更為穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物。VIDAL-GARCíA等[21]發(fā)現(xiàn)，bmGT可在獲得曲霉菌感染證據(jù)之前被檢測到，且不存在于健康人群當(dāng)中?？刹捎贸Ｒ?guī)ELISA間接檢測bmGT；為證實(shí)此結(jié)論，他們檢測了90例疑似IPAI患者的357份血清中bmGT水平，結(jié)果顯示敏感性為61.5%、特異性為93%、PPV為25.0%、NPV為98.5%。與GM聯(lián)合檢測，PPV和NPV分別為100%和97.5%。但血清中的bmGT存在時(shí)間短，易與組織和細(xì)胞整合而影響檢測結(jié)果。

4.6 曲霉菌特異性IgG抗體檢測

曲霉菌特異性IgG抗體是機(jī)體應(yīng)對曲霉菌感染產(chǎn)生的特異性抗體，檢測此抗體有助于IPAI的診斷。2013年，國際人類與動物真菌國際學(xué)會將血清曲霉菌特異性IgG抗體作為診斷變態(tài)反應(yīng)性（過敏性）支氣管肺曲霉?。╝llergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA）的首要條件。夏云等[10]采用熒光免疫酶法對IPAI患者血清中曲霉菌特異性IgG抗體進(jìn)行檢測，當(dāng)以50 mmol/L為閾值時(shí)，其敏感性和特異性可達(dá)77%和78%。但因特異性抗體IgG是在曲霉菌感染機(jī)體一段時(shí)間后才出現(xiàn)在血清中的，所以此法不適于IPAI的早期診斷；另外，IPAI患者往往免疫功能低下，機(jī)體難以產(chǎn)生充分的免疫應(yīng)答，血清特異性IgG水平可能低于檢測限，提高該方法的靈敏度非常重要。AGARWAL等[22]的研究結(jié)果表明，煙曲霉特異性IgG抗體是診斷ABPA最敏感的檢測指標(biāo)，在國際上已被廣泛應(yīng)用。我國已開發(fā)出曲霉菌IgG抗體商品化試劑盒，此試劑盒需血清200 μL，檢測方法為ELISA，檢測值＜80 AU/mL為陰性，80～120 AU/mL為灰區(qū)，≥120 AU/mL為陽性，適用于慢性肺曲霉?。╟hronic pulmonary aspergillosis，CPA）及ABPA等曲霉菌感染的輔助診斷，可在臨床實(shí)驗(yàn)室普及。

4.7 VOC檢測

曲霉菌可產(chǎn)生特異性VOC，IPAI患者呼氣樣本中含有大量的VOC，是一種潛在的診斷標(biāo)志物。VOC檢測具有樣本采集方便、無創(chuàng)、價(jià)廉、幾分鐘可出結(jié)果、可重復(fù)采集和不需患者主動配合等優(yōu)點(diǎn)，但檢測結(jié)果易受其他致病菌、肺疾病等多種因素影響。CHAMBERS等[23]采用色譜-質(zhì)譜法確定了2-戊基呋喃是煙曲霉菌的特異性VOC，其他哺乳動物和大多數(shù)細(xì)菌的新陳代謝都不含有此種物質(zhì)。曾秋瓊等[24]發(fā)現(xiàn)VOC檢測診斷煙曲霉感染的特異性為78%、敏感性為77%。電子鼻可用于替代檢測VOC，當(dāng)電子鼻的檢測系統(tǒng)接觸到呼出的氣體時(shí)，其中的傳感器會與不同的VOC反應(yīng)，每種VOC都將形成一個特定的傳感信號，這種診斷技術(shù)安全、無創(chuàng)、簡單。HEINZ等[25]發(fā)現(xiàn)，此方法檢測曲霉菌的敏感性和特異性分別為100.0%和83.3%?？梢?，VOC檢測有望成為新的IPAI診斷方法。

4.8 D-甘露聚醇檢測

D-甘露聚醇是曲霉菌生長過程中的特異性代謝產(chǎn)物，楊燕等[26]進(jìn)行的動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，曲霉菌感染后D-甘露聚醇水平明顯升高，提示D-甘露聚醇檢測可間接診斷臨床IPAI。但因D-甘露聚醇受曲霉菌屬、感染機(jī)體中的生長狀態(tài)、抗真菌藥物、細(xì)菌或其他真菌生長抑制及人體代謝產(chǎn)物的影響，其在血清中水平變化較大，需要進(jìn)一步研究，才能在臨床開展。

4.9 鐵載體/鐵載體蛋白檢測

鐵載體是主要存在于細(xì)菌和真菌中，能合成并輸出一種螯合鐵的低分子復(fù)合物，通過鐵載體和鐵載體蛋白表達(dá)。曲霉菌在感染宿主細(xì)胞過程中會產(chǎn)生一種最具有殺傷力的曲霉菌毒素（鐵載體蛋白），以保證其對鐵元素的需求。曲霉菌毒素是曲霉菌在低鐵應(yīng)激條件下產(chǎn)生的相對分子質(zhì)量較小的高鐵離子特異性螯合劑，常用檢測方法包括：（1）薄層層析法（thin-layer chromatography，TLC），針對不同的臨床樣本，用提取溶劑將曲霉菌毒素從樣本中提取出來，經(jīng)柱層析凈化，再在薄層板上層析展開、分離，通過曲霉菌毒素的熒光性強(qiáng)弱，與標(biāo)準(zhǔn)比較而得出；（2）比色法，包括薄層色譜、氣相色譜、液相色譜；（3）免疫化學(xué)（膠體金免疫層析法、ELISA）法，簡便常用。

4.10 細(xì)胞因子檢測

細(xì)胞因子由先天性免疫系統(tǒng)在抗真菌感染過程中分泌。曲霉菌感染后，機(jī)體的免疫活性細(xì)胞受真菌抗原刺激可釋放白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、IL-1β、IL-6和IL-10等。另外，曲霉菌抗原誘發(fā)Th2型免疫反應(yīng)，產(chǎn)生IL-4、IL-5和IL-1等細(xì)胞因子。采用ELISA檢測血清或BALF中細(xì)胞因子含量，可在臨床癥狀出現(xiàn)之前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子水平的升高。HELDT等[27]探討了血清和BALF中細(xì)胞因子水平與IPAI的相關(guān)性，結(jié)果顯示，IL-6和IL-8水平與IPAI存在相關(guān)性，當(dāng)檢測值較高時(shí)，對IPAI有診斷價(jià)值。胡曉艷等[28]報(bào)道了20例具有曲霉菌感染高風(fēng)險(xiǎn)的老年患者血清中IL-10水平降低，TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平均升高。提示ELISA檢測血清細(xì)胞因子具有較好的敏感性和較高的特異性，能夠快速、準(zhǔn)確地檢測到患者血清中具有顯著意義的細(xì)胞因子。

5 質(zhì)譜分析技術(shù)

5.1 基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）

MALDI-TOF MS技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜技術(shù)，由基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源和飛行時(shí)間質(zhì)量分析器2部分組成。AERNI等[29]的研究發(fā)現(xiàn)，這一新興的生物質(zhì)譜的組織成像技術(shù)對于發(fā)現(xiàn)疾病生物標(biāo)志物具有重要意義。MALDI-TOF MS具有靈敏性、準(zhǔn)確度、分辨率高及自動化、高通量及成本低等優(yōu)點(diǎn)，越來越多地被應(yīng)用于多個領(lǐng)域，并逐漸被用于曲霉菌感染的實(shí)驗(yàn)室診斷，通過檢測特定蛋白指紋圖譜，與數(shù)據(jù)庫比對后識別特定曲霉菌，可鑒定到種的水平，是對多種曲霉菌進(jìn)行常規(guī)鑒定的有效工具。MARTY等[30]以DNA測序?yàn)閰⒖紭?biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定319株臨床絲狀真菌，對曲霉菌的鑒定準(zhǔn)確率為93.6%。張福軍等[31]從IPAI患者臨床樣本中分離出曲霉菌后，提取用于MALDI-TOF MS鑒定的核糖體蛋白，保存于不同條件下，采用MALDI-TOF MS技術(shù)對其進(jìn)行鑒定，比較不同保存條件下的鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在4 ℃、-20 ℃和-80 ℃溫度下保存鑒定正確率分別為97.73%、98.01%和97.73%。上述研究結(jié)果均表明，MALDI-TOF MS技術(shù)或可替代DNA測序，可大大縮短曲霉菌屬鑒定時(shí)間，結(jié)果可靠，有利于早期抗曲霉菌治療。

5.2 特異性雙糖質(zhì)譜分析技術(shù)

特異性雙糖質(zhì)譜分析技術(shù)是利用MALDITOF MS技術(shù)發(fā)展起來的可用于檢測曲霉菌的一項(xiàng)新技術(shù)。曲霉菌側(cè)流儀應(yīng)用MALDI-TOF MS技術(shù)檢測真菌感染時(shí)血清中生物標(biāo)志物的特異性雙糖可快速診斷IPAI，該方法具有簡單、快速、通量高、成本低等特點(diǎn)。PAIVA等[6]對2018年重癥監(jiān)護(hù)病房潛在呼吸道感染患者的研究發(fā)現(xiàn)，特異性雙糖質(zhì)譜分析較G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)的結(jié)果更可靠，適用于存在IPAI高風(fēng)險(xiǎn)患者的感染監(jiān)控，其診斷價(jià)值優(yōu)于G試驗(yàn)及BALF培養(yǎng)，與BALF-GM試驗(yàn)相似，特異性較高，但敏感性欠佳，且診斷特異性與是否開始預(yù)防性抗真菌治療無關(guān)。由于特異性雙糖質(zhì)譜分析、GM試驗(yàn)、G試驗(yàn)檢測的產(chǎn)物——雙糖、GM、1，3-β-D-葡聚糖等幾種生物標(biāo)志物在真菌感染的不同時(shí)期水平有所不同，所以聯(lián)合檢測不同生物標(biāo)志物可提高臨床診斷效能。

6 LFD

THORNTON[32]在2008年發(fā)現(xiàn)了單克隆抗體MAb JF5，此抗體的特異性抗原是一種細(xì)胞外糖蛋白，這種糖蛋白主要存在于曲霉菌菌絲細(xì)胞壁、胞間隔和圍繞細(xì)胞的莢膜層中，在曲霉菌快速活躍生長期連續(xù)分泌。LFD檢測MAb JF5抗體可快速診斷IPAI，采用膠體金法，將單克隆抗體MAb JF5固定在醋酸纖維膜上，檢測曲霉菌特定抗原成分，顯色強(qiáng)度與該抗原濃度成正比，結(jié)果分陰性、弱陽性、中等陽性和強(qiáng)陽性，10～15 min即可判讀結(jié)果。HOENIGL等[33]采集了78份BALF樣本進(jìn)行LFD檢測，結(jié)果顯示敏感性為80%、特異性為95%、PPV為80%、NPV為95%。PAN等[34]采用LFD檢測患者血清，結(jié)果表明，LFD的檢測敏感性為68%、特異性為87%。EIGL等[35]通過檢測BALF，并與G試驗(yàn)和LFD聯(lián)用，發(fā)現(xiàn)LFD檢測IPAI的敏感性和特異性分別為94%和93%，提示采用膠體金法進(jìn)行LFD檢測或聯(lián)合檢測具有簡便、快速和診斷準(zhǔn)確的特點(diǎn)，有望用于臨床常規(guī)檢測。

7 聯(lián)合檢測

聯(lián)合檢測有不同組合模式，可不同程度提高IPAI的陽性診斷率、敏感性、特異性、PPV、NPV、準(zhǔn)確性，降低漏診率。

7.1 G試驗(yàn)聯(lián)合GM試驗(yàn)

GM是一種曲霉菌細(xì)胞壁外層的多聚糖物質(zhì)，曲霉菌侵襲組織早期，GM可被釋放入血，且可持續(xù)1～8周，在癥狀和體征出現(xiàn)前即可反映出機(jī)體曲霉菌感染。有研究結(jié)果[1]表明，G試驗(yàn)診斷IPAI的敏感性為78.3%、特異性為77.2%、PPV為80.4%、NPV為74.9%、準(zhǔn)確性為77.8%、漏診率為21.7%；GM試驗(yàn)敏感性為86.3%、特異性為93.0%、PPV為91.4%、NPV為88.7%、準(zhǔn)確性為89.9%、漏診率為13.7%；檢測敏感性、特異性和抗體量、受檢人群、試驗(yàn)方法、判斷標(biāo)準(zhǔn)、患者免疫狀態(tài)均會影響G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)的檢測效能，因此2種方法聯(lián)合檢測可提高IPAI的檢出率。于書嫻等[36]關(guān)于G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)對侵襲性真菌病診斷價(jià)值的Meta分析結(jié)果顯示，聯(lián)合試驗(yàn)敏感性為88%、特異性為81%，1種方法為陽性結(jié)果的敏感性優(yōu)于2種方法均為陽性結(jié)果，特異性剛好相反；單獨(dú)檢測時(shí)，G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)診斷效果相似；聯(lián)合檢測比單獨(dú)檢測有較高的診斷效果，且2種方法均為陽性時(shí)診斷效果最好。

7.2 GM試驗(yàn)聯(lián)合痰培養(yǎng)

GM試驗(yàn)對早期診治IPAI可起到積極作用，且血清樣本采集方便。而傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)方法存在陽性檢出率低、耗時(shí)長、痰液樣本易受污染等缺點(diǎn)。劉利華等[37]發(fā)現(xiàn)痰培養(yǎng)敏感性和特異性分別為60.4%和69.9%，GM試驗(yàn)敏感性和特異性分別為94.3%和94.5%，2種方法聯(lián)合可將敏感性和特異性分別提高到98.1%和99.4%。

7.3 BALF-GM試驗(yàn)聯(lián)合TAFC

ORASCH等[38]發(fā)現(xiàn)，ELISA聯(lián)用BALF-GM試驗(yàn)與TAFC檢測診斷血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者IPAI的敏感性從單用GM試驗(yàn)的53%（以1.0為臨界值）和73%（以0.5為臨界值）分別提高到73%和87%，提示TAFC檢測聯(lián)合BALF-GM試驗(yàn)診斷IPAI效果更好。

7.4 BALF聯(lián)合血清GM試驗(yàn)

有研究發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合檢測BALF與血清GM診斷IPAI的敏感性、特異性、符合率均＞90%[39]。IPAI早期，血液中GM水平較低，且當(dāng)宿主免疫功能正常時(shí)，中性粒細(xì)胞會提高GM清除率，因此，若患者免疫功能正常，血清GM檢測在早期IPAI診斷中敏感性較差。肺部是曲霉菌感染的靶器官，其局部負(fù)載要顯著高于其他體液，因此BALF GM試驗(yàn)?zāi)軌蜉^血清GM試驗(yàn)更準(zhǔn)確、快速地診斷出早期IPAI。鄧勁等[40]對206例臨床高危非粒細(xì)胞缺乏IPAI患者進(jìn)行血清GM試驗(yàn)，結(jié)果顯示陽性93例，檢測敏感性為89%、特異性為83%、PPV為86%、NPV為91%、約登指數(shù)為0.72、診斷符合率為78%。BALF GM水平均高于血清樣本，陽性率也高于血清樣本。提示BALF聯(lián)合血清GM檢測對IPAI更有診斷價(jià)值，優(yōu)于單一樣本單獨(dú)檢測，尤其對于免疫功能未知患者更有意義，可大大提高診斷效能。

7.5 PCR聯(lián)合G試驗(yàn)或GM試驗(yàn)

PCR檢測血曲霉菌DNA，可在極短的時(shí)間內(nèi)檢測到極微量的真菌DNA，報(bào)陽時(shí)間要早于G試驗(yàn)與GM試驗(yàn)。PCR的方法學(xué)、試劑的標(biāo)準(zhǔn)性和可靠性對結(jié)果影響較大，不同研究的敏感性和特異性差異較大；單獨(dú)應(yīng)用PCR診斷IPAI的敏感性和特異性分別為50%～100%和89%；單次PCR陽性的敏感性略高于單次GM試驗(yàn)陽性，特異性則顯著性升高（P＜0.05）；2次PCR陽性敏感性與2次GM試驗(yàn)陽性相同，但是特異性顯著性升高（P＜0.05）[5]。提示PCR對于IPAI診斷優(yōu)于GM試驗(yàn)。《感染相關(guān)生物標(biāo)志物臨床意義解讀專家共識》[13]指出，如果將PCR檢測血曲霉菌DNA或G試驗(yàn)與GM試驗(yàn)結(jié)合起來，可提高診斷的準(zhǔn)確性。BOCH等[41]對BALF樣本進(jìn)行GM試驗(yàn)和PCR聯(lián)合檢測，其診斷IPAI的敏感性和特異性分別為85%和97%，PPV為94%、NPV為90%。提示PCR檢測血曲霉菌DNA聯(lián)合血清學(xué)方法（GM試驗(yàn)）可以提高診斷的敏感性和特異性，優(yōu)于單一檢測。

7.6 LFD聯(lián)合BALF-GM試驗(yàn)

GM試驗(yàn)操作較復(fù)雜、耗時(shí)長，而LFD操作簡單（膠體金法）、檢測時(shí)間較短（15 min），且在免疫缺陷宿主及非粒細(xì)胞缺乏宿主IPAI的檢測中，均體現(xiàn)出較高的診斷價(jià)值。HOENIGL等[42]在診斷免疫缺陷患者IPAI時(shí)發(fā)現(xiàn)，BALF-LFD的敏感性、特異性、NPV和PPV分別可達(dá)到80%、95%、80%和95%。對BALF樣本進(jìn)行G試驗(yàn)和LFD試驗(yàn)聯(lián)合檢測的敏感性和特異性分別為90%和93%。EIGL等[35]發(fā)現(xiàn)LFD試驗(yàn)診斷IPAI的敏感性和特異性分別為94%和93%。于書嫻等[36]發(fā)現(xiàn)BALFGM試驗(yàn)的敏感性為57%～88%、特異性為87%～95.8%；BALF-LFD的敏感性為77%～91%、特異性為83%～92%。LFD和BALF-GM試驗(yàn)聯(lián)合檢測可提高敏感性和特異性，具有更高的診斷價(jià)值，能夠更好地滿足臨床需求。

8 總結(jié)

曲霉菌感染的診斷比較復(fù)雜，理想的診斷方法應(yīng)具備快速、敏感、特異等特點(diǎn)。免疫組化是IPAI的金標(biāo)準(zhǔn)，可做出相對特異性的診斷，但取材為侵入性操作，且不能判斷曲霉菌種類，成本高、抗體制備困難。涂片鏡檢和培養(yǎng)法陽性率低，且培養(yǎng)耗時(shí)長。G試驗(yàn)和GM試驗(yàn)易受患者病程等因素的影響；PCR的方法學(xué)、試劑的標(biāo)準(zhǔn)性和可靠性對結(jié)果影響較大。GM試驗(yàn)、G試驗(yàn)、PTX-3、細(xì)胞因子、TAFC、bmGT、曲霉菌特異性IgG抗體、曲霉菌特異性VOC、D-甘露聚醇和鐵載體/鐵載體蛋白等生物標(biāo)志物檢測及特異性雙糖質(zhì)譜分析、LFD診斷價(jià)值較高，操作更簡單，獲得結(jié)果時(shí)間更短，對診治和監(jiān)測IPAI意義更大，但統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)化操作、臨界值、試劑來源和標(biāo)準(zhǔn)有待深入研究。為了準(zhǔn)確診斷IPAI，應(yīng)將傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)檢查、培養(yǎng)法與非培養(yǎng)法結(jié)合起來，并聯(lián)合多種診斷技術(shù)，包括臨床診斷和病原學(xué)診斷技術(shù)等，以滿足臨床要求。