番石榴葉中總黃酮的提取及其抗氧化活性研究

李丙添，宋鳳蘭，劉銳鋒，廖礎(chǔ)欣，趙偉國(guó)

(1.中山市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 中山 528403；2.廣東藥科大學(xué)中山校區(qū)，廣東 中山 528400)

對(duì)于桃金娘科番石榴樹植物中的番石榴，其干燥葉以及帶葉嫩枝就是番石榴葉，在我們?nèi)A南地區(qū)多有種植，資源豐富[1]。在中醫(yī)領(lǐng)域中，認(rèn)為番石榴味澀以及性平，具有清熱解毒、燥濕健脾的功效。而通過現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，番石榴的抗病毒、抗瘧、止瀉、降血糖血脂等藥理作業(yè)非常顯著[2-4]。番石榴葉中的黃酮、酚類、多糖、皂苷、揮發(fā)油等功能成分含量較大，特別是黃酮類化合物和其抗菌消炎、降血糖、降血脂、抗病毒等方面有著直接關(guān)系，具有很高的研究?jī)r(jià)值[5-6]。本課題采用超聲法提取番石榴葉中的總黃酮，采用正交實(shí)驗(yàn)方式對(duì)番石榴葉總黃酮的提取工藝展開優(yōu)化，并對(duì)提得總黃酮的抗氧化活性進(jìn)行考察，為其后續(xù)深入開發(fā)以及應(yīng)用提供理論保障。

1 材料與試劑

紅心番石榴葉采自廣東省湛江市，經(jīng)鑒定為桃金娘科番石榴屬番石榴葉；采用天津市大茂化學(xué)試劑廠的三氨基甲烷、焦性沒食子酸、硝酸鋁；采用上海伊卡生物技術(shù)有限公司的DPPH、ABTS；采用天津市永大化學(xué)試劑有限公司的硫酸亞鐵、水楊酸、30%雙氧水、過硫酸鉀、鹽酸；其他實(shí)際都選擇分析純。

選擇昆山市超聲儀器有限公司的KQ-100VDE三頻數(shù)控超聲波清洗器；選擇上海美譜達(dá)儀器有限公司的V-1100型可見分光光度計(jì)；選擇溫嶺市林大機(jī)械有限公司的搖擺式高速萬能粉碎機(jī)；選擇上海博迅實(shí)業(yè)有限公司GZX-9240MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱。

2 方法與結(jié)果

2.1 番石榴葉總黃酮的含量測(cè)定

參考有關(guān)文獻(xiàn)，采用Al(NO3)3直接顯色法測(cè)定番石榴葉總黃酮含量[7]。移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液或待測(cè)樣品液1mL于25mL容量瓶中，添加1mL的10%Al(NO3)3溶液，混勻，之后靜止放置6分鐘，采用70%乙醇進(jìn)行定容處理，保證滿足刻度要求，之后搖勻并靜止放置10分鐘，在413納米位置開展吸光度的測(cè)試工作。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.0128～0.0896mg/mL的范圍內(nèi)，吸光度與濃度的線性方程為Y=19.852X+0.1224，r=0.9996，線性關(guān)系良好。

2.2 改進(jìn)番石榴葉的總黃酮提取工藝

番石榴葉40℃干燥至恒重，粉碎過40目篩，得番石榴葉粉末備用。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，選擇超聲法提取番石榴葉中總黃酮。稱取0.500g番石榴葉粉末，置具塞三角瓶中，加入一定比例的70%乙醇，稱重，浸潤(rùn)5min，于50℃、功率100w、頻率80Hz的條件下，采用超聲方式開展提取工作，時(shí)間為30分鐘，冷卻，溶劑補(bǔ)足重量，過濾，得總黃酮提取液。

2.2.1提取工藝單因素考察

(1)總黃酮提取效果受到乙醇濃度的影響情況

稱取0.500g番石榴葉粉末6份，并添加到10mL的40%、50%、60%、70%、80%、95%的乙醇(料液比1∶20)中，于50℃條件下，采用超聲方式開展提取工作，時(shí)間為30分鐘，通過提取液進(jìn)行總黃酮含量計(jì)算，并對(duì)該工藝提取率進(jìn)行計(jì)算。由結(jié)果可見，番石榴葉中的總黃酮提取效果會(huì)受到乙醇濃度影響，若是乙醇的濃度低于80%，則總黃酮提取率和乙醇濃度之間屬于正比關(guān)系。若是乙醇的濃度超出80%，則黃銅提取效率并不會(huì)隨之增加，還會(huì)出現(xiàn)一定下降。故番石榴葉總黃酮超聲提取，應(yīng)該盡量選擇80%左右的乙醇。

(2)總黃酮提取效果受到料液比的影響情況

稱取0.500g番石榴葉粉末6份，分別按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30加入70%的乙醇，于50℃條件下，采用超聲方式開展提取工作，時(shí)間為30分鐘，通過提取液進(jìn)行總黃酮含量計(jì)算，并對(duì)該工藝提取率進(jìn)行計(jì)算。由結(jié)果可見，提取溶劑用量越大，黃酮提取率越高，降低料液比有利于黃酮類物質(zhì)的溶解與擴(kuò)散，提取效果更佳。但也可以看出，當(dāng)料液比小于1∶20時(shí)，番石榴總黃酮提取率增幅變緩。綜合考慮生產(chǎn)成本，料液比選擇1∶25左右較佳。

(3)總黃酮提取效果受到溫度的影響情況

稱取0.500g番石榴葉粉末5份，各加入70%的乙醇10mL(料液比1∶20)，分別于40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，采用超聲方式開展提取工作，時(shí)間為30分鐘，通過提取液進(jìn)行總黃酮含量計(jì)算，并對(duì)該工藝提取率進(jìn)行計(jì)算。通過計(jì)算結(jié)果能夠發(fā)現(xiàn)，溫度并不會(huì)對(duì)航通提取效率產(chǎn)生較大影響。這可能是因?yàn)槌曁崛囟仁峭ㄟ^外部水浴溫度調(diào)控的。雖外部水浴控制一定溫度，但溶劑內(nèi)部會(huì)局部升溫，溶劑溫度短時(shí)間難以與外部水浴一致，不同提取溫度下，溶劑內(nèi)部溫度相差并不大。40℃～60℃時(shí)提取率隨溫度增加而增大，溫度超過60℃，提取率反而下降。故提取溫度選擇60℃左右較佳。

(4)總黃酮提取效果受到時(shí)間的影響情況

稱取0.500g番石榴葉粉末6份，各加入70%的乙醇10mL(料液比1∶20)，于50℃分別超聲20min、25min、30min、35min、40min、45min，提取液測(cè)定總黃酮含量，計(jì)算總黃酮提取率。由結(jié)果可見，超聲提取時(shí)間小于40min時(shí)，在時(shí)間不短延長(zhǎng)過程中，黃酮提取效率不斷增加，但提取時(shí)間超過40min，提取率反而有所下降。因此，提取時(shí)間選擇40min左右較佳，見圖1。

圖1 番石榴葉總黃酮提取率受到乙醇濃度、料液比、溫度、時(shí)間的影響情況

2.2.2正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝

結(jié)合單因素的實(shí)驗(yàn)情況，采用溫度、時(shí)間、料液比以及乙醇4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化總黃酮提取工藝，詳見表1、表2、表3。

表1 正交實(shí)驗(yàn)中相關(guān)因素以及水平情況

表2 番石榴葉總黃酮正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析表

由正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果(表2，表3)可知，上述因素中，乙醇濃度對(duì)于黃酮提取效率影響最為嚴(yán)重，料液比次之，溫度對(duì)于黃酮提取效率影響最小，并且料液比和乙醇濃度對(duì)于黃酮提取的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于溫度和時(shí)間的影響，有顯著性差異。A2B3C1D2是番石榴葉總黃酮的最佳提取工藝。即乙醇濃度為80%，料液比為1∶30，提取溫度為55℃，提取時(shí)間為40min。按照該工藝技術(shù)進(jìn)行總黃酮提取，重復(fù)3次，平均提取率為(4.668±0.18)%，表明該工藝具有良好穩(wěn)定性，并且提取率充分滿足預(yù)期要求。

2.3 番石榴葉總黃酮體外抗氧化活性研究

以上述番石榴葉中的總黃酮最佳提取工藝為基礎(chǔ)，參考有關(guān)文獻(xiàn)[8-9]并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)考察配制成適宜濃度的待測(cè)溶液對(duì)其DPPH、超氧陰離子自由基、羥基自由基、ABTS+自由基的清除性能展開研究。

(1)清除DPPH自由基的實(shí)驗(yàn)

加顯色劑的樣品溶液：取待測(cè)溶液5mL，加1mmol/L DPPH溶液5mL，搖勻，基于室溫避光條件，反應(yīng)30分鐘，517納米處測(cè)其吸光度記為A1。不加顯色劑的對(duì)照溶液：取待測(cè)溶液5mL，加5mL無水乙醇并搖勻，基于室溫避光條件，進(jìn)行靜止放置處理，時(shí)間為30分鐘，測(cè)其吸光度記為A2?？瞻兹芤海喝PPH溶液5mL，加5mL無水乙醇，搖勻，室溫避光靜置30min，測(cè)其吸光度記為A0。

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

番石榴葉總黃酮清除DPPH自由基的性能情況如圖2，總黃酮對(duì)DPPH自由基具有顯著清除作用，其清除能力在0.0216～0.1296mg/mL的濃度范圍內(nèi)隨樣品的濃度增加而增加，最高清除率可達(dá)62.78%。

圖2 番石榴葉總黃酮清除DPPH自由基的性能情況

(2)清除超氧陰離子自由基(O2-·)的實(shí)驗(yàn)

加顯色劑的樣品溶液：取待測(cè)溶液1mL，0.05mmol/LTris-HCl緩沖溶液4mL，鄰苯三酚鹽酸液0.5mL，混勻后靜置4min加濃HCl兩滴停止反應(yīng)，325nm處測(cè)其吸光度記為A1。不加顯色劑的對(duì)照溶液：取待測(cè)溶液1mL，0.05mmol/LTris-HCl緩沖溶液4mL，10mmol/L的鹽酸0.5mL混勻，靜置4min加濃HCl兩滴停止反應(yīng)，測(cè)其吸光度記為A2?？瞻兹芤海喝?0%乙醇1mL，0.05mmol/LTris-HCl緩沖溶液4mL，鄰苯三酚鹽酸液0.5mL，混勻后靜置4min加濃HCl兩滴停止反應(yīng)，測(cè)其吸光度記為A0。

超氧陰離子自由基(O2-·)清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

由圖3可見番石榴葉總黃酮對(duì)超氧自由基(O2-·)雖清除率不高，但仍有一定程度的清除作用，其清除能力在0.0306～0.0714mg/mL的濃度范圍內(nèi)與樣品的濃度有正相關(guān)的量效關(guān)系。

圖3 番石榴葉總黃酮清除超氧陰離子自由基性能情況

(3)對(duì)羥自由基(·OH)的清除實(shí)驗(yàn)

加顯色劑的樣品溶液：取待測(cè)溶液0.5mL，依次加入9mmol/LFeSO4溶液0.5mL，9mmol/L水楊酸-乙醇液0.5mL，8.8mmol/LH2O2溶液0.5mL，純化水定容至10mL，避光靜止放置30分鐘，510納米處進(jìn)行吸光度定并記為A1。不加顯色劑的對(duì)照溶液：取待測(cè)溶液0.5mL，依次加入9mmol/LFeSO4溶液0.5mL，9mmol/L水楊酸-乙醇液0.5mL，純化水定容至10mL，避光靜止放置30分鐘，測(cè)其吸光度記為A2。空白溶液：取70%乙醇0.5mL，依次加入9mmol/LFeSO4溶液0.5mL，9mmol/L水楊酸-乙醇液0.5mL，8.8mmol/LH2O2溶液0.5mL，純化水定容至10mL，避光靜止放置30分鐘，測(cè)其吸光度記為A0。

羥自由基(·OH)清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

圖4 番石榴葉總黃酮對(duì)羥自由基的清除作用

結(jié)果可見，番石榴葉總黃酮可以充分清除Fenton體系產(chǎn)生的羥自由基，并呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。在0.216～1.512mg/mL的濃度范圍內(nèi)，在黃酮濃度不斷增大過程中，其清除羥自由基的效果更加顯著，清除率可達(dá)92.35%。

(4)對(duì)ABTS+自由基的清除實(shí)驗(yàn)

加顯色劑的樣品溶液：取待測(cè)溶液1mL，加入7mmol/LABTS+溶液4mL，靜置30min，于734nm處測(cè)其吸光度記為A1。不加顯色劑的對(duì)照溶液：取待測(cè)溶液1mL，加純水4mL，靜置30min，測(cè)其吸光度記為A2?？瞻兹芤海喝?0%乙醇1mL，加入7mmol/LABTS+溶液4mL，靜置30min，測(cè)其吸光度記為A0。

ABTS+自由基清除率=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

圖5 番石榴葉總黃酮對(duì)ABTS+自由基的清除作用

結(jié)果可見，番石榴葉總黃酮對(duì)ABTS+自由基具有較為顯著清除作用，在0.015～0.090mg/mL的濃度范圍內(nèi)清除率與濃度幾乎成正相關(guān)，在0.126mg/mL的濃度時(shí)，清除率更是高達(dá)99.81%。

3 討論

NaNO2-Al(NO3)3-NaOH系統(tǒng)顯色是黃酮含量測(cè)定的常用方法[10]，但對(duì)番石榴葉總黃酮顯色時(shí)，發(fā)現(xiàn)NaNO2-Al(NO3)3-NaOH顯色處理會(huì)有棕褐色沉淀，可能是提取液中其它成分干擾所致，故本實(shí)驗(yàn)選擇Al(NO3)3直接顯色對(duì)番石榴葉總黃酮含量展開測(cè)定，方法學(xué)驗(yàn)證該含測(cè)方法穩(wěn)定可行。

選擇番石榴葉總黃酮具體提取方法時(shí)，曾考察了回流法、溫浸法、超聲法、微波提取等，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲提取提取率較高，且操作簡(jiǎn)單易行，本課題選擇了超聲法來提取番石榴葉總黃酮。通過采用正交優(yōu)化以及發(fā)因素考察的方式對(duì)提取工藝展開改進(jìn)，最終得到80%溢出，料液比1∶30，提取溫度55℃，提取時(shí)間40min是總黃酮最佳提取工作，總黃酮提取率可達(dá)4.7%左右。

體外抗氧化研究表明，番石榴葉總黃酮對(duì)DPPH、·OH、O2-及ABTS+均有一定的清除效果，并且在一定范圍內(nèi)作用效果與濃度有量效關(guān)系，當(dāng)清除率達(dá)到飽和時(shí)則不再隨著濃度的增加而增加。但是其對(duì)各自由基的清除強(qiáng)度不同，僅從最大清除率比較而言，番石榴葉總黃酮抗氧化性由強(qiáng)到弱依次為ABTS+>·OH>DPPH·>O2-·。