OECD微生物農藥中次級代謝物的風險評估

宋俊華，王以燕，邢立國*

(1.沈陽沈化院測試技術有限公司，遼寧 沈陽 110021；2.農業(yè)農村部農藥檢定所，北京 100125)

微生物次級代謝物因其產生過程、條件以及自身性質的特殊性，對其進行風險評估是微生物農藥登記評審中的難點，我國現行《農藥登記資料要求》并未對該部分內容提出相關要求。經濟合作與發(fā)展組織(OECD)2018年發(fā)布的98號工作文件(Working Document on the Risk Assessment of Secondary Metabolites of Microbial Biocontrol Agent)(以下簡稱“OECD98號文件”)對微生物農藥中次級代謝物的風險評估進行了詳細介紹，本文對其中的部分重點內容進行了總結和梳理，供管理部門制定相關政策及農藥企業(yè)申請產品境外登記時提供參考。

微生物代謝物分為初級代謝物(Primary Metabolites)和次級代謝物(Secondary Metabolites 以下稱為SM)，前者是指微生物產生的，對其生長、擴展或繁殖必需的化合物，后者是指微生物產生的，對其生長、擴展或繁殖非必需的化合物，且次級代謝物由初級代謝物通過生化合成產生。相關次級代謝物(relevant secondary metabolite)是指對人類健康和/或環(huán)境可能構成一定危害的次級代謝物。

雖然對SM的管理通常參照化學農藥的要求，但SM與化學農藥代謝物不同之處在于：SM通常為一組化合物，其產生受其他生物或非生物因素的影響，或在微生物與寄主或靶標生物接觸時才產生，部分為有效成分的組成部分。SM主要由放線菌和真菌產生，已經被確認的SM主要包括：真菌毒素(mycotoxin)、植物毒素(phytotoxin)、外毒素(exotoxin)和抗生素(antibotics)。在OECD98號文件中，SM不包括酶和內毒素。內毒素一般由革蘭氏陰性菌產生，但蘇云金芽孢桿菌也可產生內毒素，稱為delta毒素，即具有殺蟲活性的晶體蛋白，是該類產品生物活性及有效成分的一部分。

對微生物中SM的風險評估主要依賴基礎信息、環(huán)境中暴露和持久性等數據進行。參照OECD對植物源農藥的管理模式，為便捷對SM的管理，該工作文件依據現有信息將微生物農藥分為以下3類：1.已知對人類、動物和環(huán)境無負面影響的微生物。2.根據分類及現有信息，可能產生對人類、動物和環(huán)境造成危害的SM的微生物，此種情況下需要對SM進行定性定量分析，如可產生真菌毒素的木霉菌(Trichoderma spp)。3.無可靠相關信息的微生物。

1 基礎信息

SM的風險評估從基礎信息開始，其內容包括：1.產生SM的微生物的特性，包括鑒別和分類、生理習性、繁殖能力、作用機制、寄主范圍、增殖條件和生產工藝、在環(huán)境或食品/飼料中的分布、生成和暴露，以及與已知能夠產生相同SM菌種的相關性等。但同一SM可由相近或完全不同的菌種產生，因此對于一個全新的微生物農藥，即使沒有與已知可產生同一SM的菌種有關聯(lián)，也不能完全排除其產生SM的可能性。2.微生物產品特性，包括產品劑型和詳細的產品組成、防治作物和對象、使用時間和劑量等。3.SM的特性，包括結構和命名、存在于細胞里或外、產生的基因代碼序列、穩(wěn)定性、作用機制、對人類/哺乳動物或其他非靶標生物的影響、產生的環(huán)境條件及調節(jié)機制，以及對微生物產品作用機制的影響等。4.微生物與靶標生物的相關性，包括防治對象和藥效數據等。5.微生物與非靶標生物的關系，包括微生物不屬于有效抗生素和人類致病菌的信息、相關的醫(yī)學報告以及非靶標生物清單等。此外，公開發(fā)表的相關信息以及QSAR數據等，也可作為對SM進行安全性評價的輔助數據。但用QSAR對SM使進行評估的難點在于，其往往無CAS號或SMILES碼或準確的分子結構，或為一組混合物，因此無法獲得QSAR模型的輸入參數。對SM構效關系評價使用最多的為Norine 數據庫，該數據庫收錄了1 000多種肽類化合物信息，涵蓋化合物結構、活性、以及產生的有機物種類等。如基礎信息足以證明微生物產品及其產生的SM的安全性，則無需對SM進行進一步的風險評估。

2 環(huán)境中暴露和持久性

對SM的暴露評估主要依據產品劑型、有效成分含量、防治作物、推薦的使用劑量、使用方法、地點和時間以及SM在自然界中存在的濃度等信息進行。SM生成途徑有2條：1是在微生物生產過程中產生；2是在前體分子中存在或與寄主或致病菌接觸時產生。只有在前一種情況下，用微生物產品作為樣品進行的相關試驗才對評價SM的安全性有用。

表1 不同的使用方式對應的、可能受SM影響的非靶標組

對SM的風險評估需同時考慮其穩(wěn)定性和持久性。從現有的數據來看，昆蟲病原真菌產生的SM有以下幾個特點：1.在液體發(fā)酵介質中很快降解；2.在植物中不存在或含量低于檢測限；3.僅在特定的條件下穩(wěn)定；4.在使用現場因為溫度和紫外線等因素很快分解。因此當暴露到正常環(huán)境條件下時，昆蟲病原真菌產生的SM并不穩(wěn)定。對于木霉菌和細菌等產生的SM，目前已知的信息還很少。但SM的穩(wěn)定性并不能完全依據DT50/DT90的值來判定，因具有代謝活性的微生物在使用后仍可能繼續(xù)產生SM。

3 風險評估

對SM進行的風險評估涉及4個部分內容：1.毒性試驗；2.膳食風險評估；3.職業(yè)風險評估；4.非靶標組風險評估。對于毒性試驗部分，如前所述，只有SM在微生物生產過程中產生，即用于試驗樣品的微生物產品中含有該SM時，進行的相關試驗才可用于SM評價。

在下列幾種情況下需要對SM進行膳食風險評估：1.基礎信息部分數據顯示微生物產生的SM存在人體毒性風險；2.與已知產生真菌毒素的菌種相近(見工作文件8.2.1部分表3)，因為真菌毒素可能有致癌性、致突變性或生殖毒性；3.與已知的人類致病菌相近(見工作文件8.2.2部分)。如有證據支持可能形成有害的SM，則需要按照下列步驟進行進一步評估：1.產生有害SM的基因序列是否存在；2.根據使用方法和劑型確定暴露可能性，其中葉面使用風險性最高，與之相比，因導致膳食暴露的可能性較低，土壤和種子處理劑則相對安全，如有充足理由證明SM不會構成職業(yè)、路人或居民風險或膳食風險，風險評估也可到此為止。否則繼續(xù)以下步驟：3.確認使用過程中產生的SM濃度，此過程需要對SM進行定量或半定量分析。4.確定毒性數據。如無毒性相關數據，也可以用食品中污染物允許最大含量確定真菌毒素的含量是否可接受，如歐盟No1881/2006號條例中規(guī)定了食品中污染物的限量，美國、中國、新加坡和巴西等也都規(guī)定了真菌毒素在食品中的限量指標?；虿捎枚纠韺W關注閾值(TTC)的方法，如基因毒性致癌物為1.5ug/人/天或25ng/kg體重/天。結合膳食消費數據，有可能計算出食品中所允許的最大量。但TTC對一些致癌性非常高的物質如黃曲霉素(aflatoxin)不適用。

職業(yè)工人和操作者也可能暴露于SM。主要暴露途徑為經皮或吸入途徑，而較少通過眼部或經口途徑。如果經皮或吸入毒性較高，則需要進行定量的風險評估。如木霉菌產生的Trichothecenes為細胞膜破壞性毒素，可能造成皮膚損傷或系統(tǒng)性疾病。尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)為除草劑，也能夠產生一系列的真菌毒素。對于在微生物生產過程中產生的SM，風險評估可以按照目前傳統(tǒng)化學農藥的方法進行。

對于SM的非靶標組風險評估，存在傳統(tǒng)生態(tài)毒理試驗的適用性、標準試驗介質制備、提取程序標準化、試驗數據重復性等多種問題，但可依據微生物及SM的相關特性申請豁免。如假單胞菌(Pseudomonas)和芽孢桿菌(Bacillus)的土壤和種子處理產品，因其會在植物根部形成一層生物膜，對非靶標組的暴露受到限制，另外，其生成的代謝物-脂肽通過破壞致病菌的細胞膜產生作用，可以排除其對非靶標組的潛在影響，且這些微生物均為土壤中普遍存在的，也不太可能對土壤中有重要環(huán)境或生態(tài)環(huán)境影響的物種構成風險。

由此可見，對微生物中次級代謝物的風險評估，較難制定統(tǒng)一的要求和流程，需要結合微生物、代謝物本身特性以及使用條件等多種情況而定，由于農藥相關標準缺乏，部分限量要求還需參照食品中的限量要求執(zhí)行，在工作文件8.3部分-全球已獲登記的微生物農藥產品清單(微生物農藥電子手冊中收錄數據)中，也僅有少量明確了次級代謝物信息。因此，為鼓勵微生物農藥發(fā)展，結合現有微生物農藥作用機制和應用場所等特點，如果明確不屬于已知的人畜或脊椎動物病原體的微生物，或雖有研究表明其可能產生有害SM，但產生條件或使用方式導致其暴露的可能性很低，國家農藥登記管理部門可考慮降低其風險評估要求，同時加強對新微生物品種的審批，對已知危害性較大的SM建立定性定量檢測方法，在促進微生物農藥發(fā)展的同時規(guī)范其管理。

該工作文件同時給出了其他有關SM的數據庫信息，以及全球登記的產生真菌毒素的真菌農藥清單、植物毒素清單(文獻數據)和微生物農藥電子手冊2014版中收集的全球登記的微生物農藥清單等，可為我國農藥管理部門在制定次級代謝物管理相關政策時提供參考。