草莓根腐病土壤拮抗放線菌的篩選

陸錚錚 熊仕俊

摘 要：為獲得草莓根腐病病原菌的拮抗放線菌，從草莓根圍土壤中分離放線菌，采用平板對峙法篩選出了2株對草莓根腐病病原菌具有拮抗作用的生防放線菌。結(jié)果顯示：同時(shí)對峙的平均抑菌直徑分別是F3-8為20毫米、F2-2為17毫米;錯(cuò)時(shí)對峙的平均抑菌直徑分別是F3-8為32毫米、F2-2為28毫米。

關(guān)鍵詞：草莓根腐病;擬盤多毛孢屬;拮抗;放線菌

草莓為薔薇科草莓屬多年生草本植物，富含維生素以及礦物質(zhì)，營養(yǎng)價(jià)值高。中國是世界上種植面積最大、產(chǎn)量最高的草莓生產(chǎn)國[1]。隨著草莓種植區(qū)的擴(kuò)大，草莓病害對草莓產(chǎn)量及品質(zhì)的影響也越來越嚴(yán)重，草莓根腐病就是其中一種危害較嚴(yán)重的病害。

草莓根腐?。⊿trawberry root rot）是一種典型的土傳性病害，在世界各地的草莓種植區(qū)均有發(fā)生，能引起根部發(fā)生病變的病害，嚴(yán)重時(shí)產(chǎn)生缺株現(xiàn)象，影響草莓的生產(chǎn)，甚至出現(xiàn)絕產(chǎn)現(xiàn)象。草莓根腐病的致病菌有多種，其中由擬盤多毛孢屬（Pestalotiopsis）引起的草莓根腐病在國內(nèi)常有報(bào)道[2]，且危害嚴(yán)重。

化學(xué)農(nóng)藥防治草莓根腐病成為傳統(tǒng)的防治該病害的方法，但是農(nóng)藥對環(huán)境和人畜的危害較大。因此，筆者通過分離草莓根圍土壤中的放線菌，采用平板對峙法將放線菌和草莓根腐病病原菌進(jìn)行對峙培養(yǎng)，篩選出拮抗放線菌，進(jìn)而研究無公害的綠色防治方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 草莓根腐病病原菌來源于安順學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)大培養(yǎng)菌種備用。

1.1.2 土壤樣品 采集于貴州省安順市大寨村草莓種植地發(fā)生根腐病的種植區(qū)中健康草莓植株的根圍土壤，共5份。

1.1.3 培養(yǎng)基[3] 病原菌的擴(kuò)大培養(yǎng)：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）;土壤放線菌的分離：高氏合成1號培養(yǎng)基;土壤放線菌的純化：燕麥粉培養(yǎng)基;平板對峙： 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離方法 采用組織分離法，將采回的草莓根腐病病株，用無菌水清洗發(fā)病的部位，選取新近發(fā)病部位一小塊組織（0.5厘米×0.5厘米），經(jīng)75%酒精消毒10～15秒后用無菌水洗3次，置于滅菌的放有濾紙的培養(yǎng)皿中，將組織表面多余的水分吸干，用滅菌的解剖刀和鑷子將組織切成4～5毫米的小塊，置于PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)，一個(gè)培養(yǎng)基可以放置3塊病組織，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天后，進(jìn)行純化，采用柯赫氏法則確定病原菌，并采用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法鑒定病原菌菌株。

1.2.2 土樣采集方法 選取種植年限較長且發(fā)病較重的草莓種植地，采集健康草莓植株的根圍土壤。取樣時(shí)撥開表土約5厘米深，每樣約50克（同地區(qū)取樣點(diǎn)至少相距100米以上），裝入自封袋并做上記號，帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2.3 土壤放線菌分離方法 將采回的土壤放于干燥無菌的地方晾7天后進(jìn)行分離。稱10克土樣置于盛有90毫升無菌水三角瓶中（瓶里放幾粒無菌玻璃珠），用搖床充分振蕩15分鐘后靜置10分鐘。取1毫升懸浮液于9毫升無菌水中，再從中取1毫升于另一支9毫升無菌水中混勻，再稀釋。如此類推就得到不同稀釋倍數(shù)的土壤懸浮液（分離放線菌所需稀釋倍數(shù)為10-2、10-3、10-4）。從各濃度的土壤懸浮液中吸取0.1毫升懸浮液分散滴于高氏合成1號平板上，再用滅菌的三角玻璃棒涂勻，靜置20分鐘后于32 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，待菌落形成后立即純化并保存。

1.2.4 拮抗放線菌的篩選方法 （1）對峙培養(yǎng)：用滅菌的接種針挑取一小塊放線菌置于PDA培養(yǎng)基的一側(cè)，用打孔器將草莓根腐病病原菌制作成直徑為5毫米的菌蝶，將菌蝶接種于PDA培養(yǎng)基的另一側(cè)（培養(yǎng)基的直徑為7.5厘米），置于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3天后觀察。（2）同時(shí)對峙：是將放線菌和病原菌同時(shí)接種于PDA中。（3）錯(cuò)時(shí)對峙：將放線菌接在PDA平板一側(cè)，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待放線菌已在培養(yǎng)基上定殖和產(chǎn)孢后（約7天），再接種病原菌于培養(yǎng)基的另一側(cè)。（4）空白對照：培養(yǎng)基的一側(cè)只接種病原菌，不接種放線菌。

1.2.5 抑菌直徑的測量方法 抑菌直徑=空白對照組平均生長出來的病原菌菌落直徑-具有放線菌對峙的培養(yǎng)皿中的平均長出的病原菌菌落直徑;平均抑菌直徑=重復(fù)的抑菌直徑之和/重復(fù)的次數(shù)。

2 結(jié)果與分析

從采集的5份健康草莓根圍土壤中分離得到22株放線菌，經(jīng)過平板對峙篩選得出2株對草莓根腐病病原菌具有拮抗作用的放線菌。其編號分別為F3-8、F2-2。2株放線菌對草莓根腐病病原菌的平均抑菌直徑如表1所示;同時(shí)接種的平板對峙效果如圖1所示;錯(cuò)時(shí)接種的平板對峙效果如圖2所示。

由表1和圖1、圖2可以看出，無論是同時(shí)對峙還是錯(cuò)時(shí)對峙，這2株放線菌對草莓根腐病病菌都有一定抑制作用，其中 F3-8拮抗放線菌對草莓根腐病的抑制作用最佳。從同時(shí)對峙和錯(cuò)時(shí)對峙對比效果看，2株拮抗放線菌都是在錯(cuò)時(shí)對峙中發(fā)揮較大的抑制作用。

3 討 論

通過分離草莓根圍土壤中的放線菌，采用同時(shí)和錯(cuò)時(shí)的平板對峙法篩選出了2株拮抗放線菌，其結(jié)果為：同時(shí)對峙的平均抑菌直徑F3-8為20毫米、F2-2為17毫米;錯(cuò)時(shí)對峙的平均抑菌直徑F3-8為32毫米、F2-2為28毫米，病原菌在沒有拮抗放線菌抑制的狀態(tài)下，培養(yǎng)3天后，菌株直徑可達(dá)61毫米，將拮抗放線菌共同培養(yǎng)后，病原菌的生長受到了明顯的抑制，其中放線菌F3-8的抑制效果比放線菌F2-2的抑制效果更佳。同時(shí)結(jié)果還表明：2株拮抗放線菌均顯示在錯(cuò)時(shí)對峙的抑制效果比同時(shí)對峙的抑制效果更好，說明放線菌需要在培養(yǎng)基上定植或產(chǎn)生抗生素之后對病原菌的抑制效果會更佳，因此在大田試驗(yàn)時(shí)，需要用拮抗放線菌的菌液浸根后移栽，這樣效果最佳。

引起草莓根腐病的病原菌可達(dá)20多種，主要有鐮孢屬、疫霉屬、炭疽菌屬、絲核菌屬、柱孢菌屬、擬盤多毛孢屬、終極腐霉屬等真菌[4]。利用拮抗細(xì)菌和真菌對草莓根腐病的防治也常有報(bào)道，如姚錦愛[5]等報(bào)道的菌株 ZZBV-3 是草莓根腐病病原菌尖孢鐮刀菌 Fusarium oxysporum 的優(yōu)良拮抗細(xì)菌;王夢園報(bào)道[6]，篩選出了3株對新棒狀擬盤多毛孢（Neopestalotiopsis clavispora）引起的草莓根腐病病原菌具有較好拮抗效果的生防細(xì)菌。張鶴[7]報(bào)道的木霉菌對由茄腐鐮孢菌（Fusarium solani）引起的草莓根腐病病原菌產(chǎn)生較強(qiáng)的抑制作用。但是，利用拮抗放線菌作為草莓根腐病病原菌拮抗菌的研究鮮有報(bào)道，因此筆者在本研究中篩選出的2株拮抗放線菌對草莓根腐病的生物防治研究具有重要的意義，為綠色防治提供了重要的生防菌株，后續(xù)將進(jìn)一步開展這2株拮抗放線菌的鑒定和拮抗機(jī)制的研究工作。

參 考 文 獻(xiàn)

[1]? 張曉慧.草莓病害研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào)，2018，24（18）： 52-57.

[2]? 劉艷茹.草莓?dāng)M盤根腐病病原菌鑒定及其防治藥劑篩選[D].沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué).2020.

[3]? 方中達(dá).植病研究方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：46-49.

[4]? 尹沙亮，鐘珊，劉奇志，等.草莓絲核菌根腐病病原菌鑒定及7種殺菌劑的抑菌作用測定[J].植物保護(hù)，2019，45（4）：132-136.

[5]? 姚錦愛，黃鵬，賴寶春，等.億貝萊斯芽胞桿菌ZZBV-3的鑒定及其對草莓根腐病的防效[J].中國生物防治學(xué)報(bào)，2021，37（1）：172-177.

[6]? 王夢園.草莓重茬病原菌的分離及其拮抗菌的篩選與應(yīng)用[D].荊州：長江大學(xué)，2020.

[7]? 張 鶴，杜國棟，宋亞楠，等.防治草莓根腐病的木霉菌篩選、鑒定及其防病效果[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46（6）：654-660.