miR-760靶基因BATF3在非小細胞肺癌組織中的表達及其對腫瘤細胞惡性生物學行為的影響

李瓊，李秋燕，張艷

(1. 蘭州新區(qū)第一人民醫(yī)院 重癥醫(yī)學科，蘭州 730300；2. 永登縣人民醫(yī)院 心血管內(nèi)科，蘭州 730300；3. 蘭州大學第一醫(yī)院 麻醉科，蘭州 730013)

肺癌是肺部最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率和死亡率居惡性腫瘤首位[1]，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)占肺癌發(fā)病率的80%以上[2]。目前，治療NSCLC的方法有手術(shù)、化療、放療、免疫治療和基因治療等，但肺癌患者，尤其是晚期肺癌患者的5年生存率僅15%，早期診斷、早期治療對提高患者的預后尤其重要[3]，超過70%的NSCLC患者首次確診時即為晚期。因此，迫切需要探究NSCLC的發(fā)生發(fā)展機制以推動臨床診治[4]。

miRNA是1類由18～28個核苷酸組成的非編碼RNA分子，在基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用并參與細胞的多種病理生理過程[5]，一些miRNA已被報道具有抑癌或原癌基因的功能[6]。目前已發(fā)現(xiàn)490多種miRNA分子[7]，miR-760是其中之一。更多的研究表明，miR-760表達的失調(diào)可見于多種惡性腫瘤，并與其生長、侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[8-13]。miR-760通過調(diào)節(jié)Notch1/HES1-PTEN/AKT信號通路抑制肝癌細胞對阿霉素的耐藥性[12]；miR-760通過靶向SP1介導的PTEN/AKT信號通路抑制結(jié)直腸癌細胞的增殖和侵襲[13]，但其在NSCLC病灶中的表達及功能尚不清楚。

1 資料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 臨床資料 收集2016年6月至2018年6月于蘭州大學第一醫(yī)院手術(shù)治療的36例NSCLC患者腫瘤組織與癌旁正常組織，所有樣本均置-80 ℃冰箱保存?；颊吣挲g(48.0±4.6) 歲， 男性/女性為20/16。所有患者TNM分期均為T1或T2期，其中T1期17例， T2期19例， 腫瘤長徑分別為(2.2±0.7) cm和(5.6±1.8) cm，患者術(shù)前均未接受任何形式抗腫瘤治療。本研究獲得蘭州大學第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者或家屬均自愿簽署知情同意書。

1.1.2 實驗材料 人傳代NSCLC細胞系(A549、H1299和H23)及正常人傳代肺上皮細胞(BEAS-2B)，均購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。DMEM培養(yǎng)液、10% FBS、TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR擴增試劑盒、MTT和細胞凋亡檢測試劑盒，均購自Sigma-Aldrich公司。miR-760模擬物(mimics)和陰性對照(negative control，NC)、pcDNA3.1-BATF3和空白對照(blank vector)、LipofectamineTM2000試劑盒，均購自Thermo Fisher Scientific公司。兔抗人多克隆BATF3抗體、兔抗人β-actin抗體和山羊抗兔IgG二抗，均購自Abcam公司。qRT-PCR引物由TaKaRa公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將1.1.2細胞系冷凍管置于37 ℃溫水浴中解凍，于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中穩(wěn)定3～4 h；用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞，待鋪底率達40%～50%時按LipofectamineTM2000 試劑盒說明書轉(zhuǎn)染miR-760至培養(yǎng)細胞，完成操作后將轉(zhuǎn)染液更換為正常細胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 RNA抽提與qRT-PCR檢測 按照說明書通過TRIzol試劑從腫瘤組織和細胞系中提取總RNA。將抽提的RNA濃度稀釋至500 ng/mL，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒從總RNA中反轉(zhuǎn)錄cDNA。qRT-PCR檢測miR-760和BATF3 mRNA的表達，擴增引物序列詳見表1。反應條件：94 ℃ 2 min，1個循環(huán)；94 ℃ 30 s，62 ℃ 40 s，35個循環(huán)。結(jié)果用2-△△Ct法計算，實驗重復3次。

表1 目標基因的引物序列

1.2.4 Western blotting檢測目標蛋白的表達 添加蛋白裂解液至組織樣本與細胞系，提取總蛋白；加入5×蛋白上樣緩沖液后煮沸10 min，用10% SDS-PAGE分離蛋白，將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜。用5%脫脂奶粉溶液封閉載體膜1 h，加入兔抗人多克隆BATF3抗體(1∶1 000)于4 ℃條件下孵育過夜；PBS漂洗后加入山羊抗兔IgG(1∶8 000)室溫孵育1 h，漂洗后滴加ECL液顯影；通過凝膠成像系統(tǒng)獲取蛋白質(zhì)條帶圖片，用ImageJ軟件分析結(jié)果，實驗重復3次。

1.2.5 MTT法檢測腫瘤細胞的增殖能力 分別取轉(zhuǎn)染后24、48、72和96 h的A549細胞，用0.25%胰蛋白酶消化后，111.8×g離心5 min；用10% FBS調(diào)整細胞密度至1.0×103個/mL；將細胞接種于96孔板，加MTT(20 μL/孔)孵育4 h；PBS漂洗3次后每孔滴加150 μL二甲基亞砜，室溫孵育15 min。通過酶標儀讀取光密度[D(490 nm)]值，計算腫瘤細胞的增殖率。

1.2.6 Transwell法檢測腫瘤細胞的遷移能力 將6×104個腫瘤細胞添加至200 μL無血清培養(yǎng)液中，過夜(饑餓)培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶消化細胞后加入10% FBS調(diào)整細胞密度至1×106個/mL。取150 μL細胞懸液接種于Transwell上室，下室加入450 μL含10% FBS的培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用90%甲醇固定，0.05%結(jié)晶紫染色，置倒置相差顯微鏡下計數(shù)。

2 結(jié)果

2.1miR-760mRNA在NSCLC腫瘤組織和細胞系中的表達qRT-PCR檢測miR-760 mRNA在36例NSCLC患者腫瘤組織與正常癌旁組織中的表達。結(jié)果顯示，miR-760 mRNA在NSCLC患者腫瘤組織中的表達量顯著低于正常癌旁組織(P<0.01，圖1A)。

qRT-PCR檢測miR-760 mRNA在NSCLC細胞系(A549、H1299和H23)及正常人肺上皮細胞(BEAS-2B)中的表達。結(jié)果顯示，miR-760 mRNA在NSCLC細胞系中的表達量顯著低于正常肺上皮細胞，且在A549細胞中的表達量最低(均P<0.01，圖1B)。

注：A. miR-760 mRNA在NSCLC腫瘤及正常癌旁組織中的相對表達量；B. miR-760 mRNA在NSCLC腫瘤細胞系、正常人肺上皮細胞中的相對表達量。與癌旁組織相比，**P<0.01； 與BEAS-2B組相比， ##P<0.01。圖1 miR-760 mRNA在NSCLC腫瘤組織和細胞系中的表達

2.2BATF3mRNA在NSCLC腫瘤組織和細胞系中的表達qRT-PCR檢測BATF3 mRNA在36例NSCLC患者腫瘤組織與正常癌旁組織中的表達。結(jié)果顯示，BATF3 mRNA在NSCLC患者腫瘤組織中的表達量顯著高于正常癌旁組織(P<0.01，圖2A)。

qRT-PCR檢測BATF3 mRNA在NSCLC細胞系(A549、H1299和H23)及正常人肺上皮細胞(BEAS-2B)中的表達。結(jié)果顯示，BATF3 mRNA在NSCLC細胞系中的表達量顯著高于正常人肺上皮細胞，且在A549細胞中的表達量最高(均P<0.01，圖2B)。

注：A. BATF3 mRNA在NSCLC腫瘤及正常癌旁組織中的相對表達量；B. BATF3 mRNA在NSCLC腫瘤細胞系、正常人肺上皮細胞中的相對表達量。與癌旁組織相比，**P<0.01； 與BEAS-2B組相比， ##P<0.01。圖2 BATF3 mRNA在NSCLC腫瘤組織和細胞系中的表達

2.3 過表達miR-760對NSCLC腫瘤細胞系惡性生物學行為的影響由于A549細胞miR-760表達量較其他細胞低(圖1)，因此，選擇將miR-760 mimics轉(zhuǎn)染至A549細胞。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染操作后miR-760相對表達量顯著上調(diào)(P<0.01，圖3A)。過表達miR-760可顯著抑制A549細胞的增殖和遷移(均P<0.01，圖3B、3C)。

注：A. 轉(zhuǎn)染實驗后A549細胞miR-760的相對表達量；B. 轉(zhuǎn)染miR-760對A549細胞增殖的影響；C. 轉(zhuǎn)染miR-760對A549細胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×400)。與miR-760 NC組相比，**P<0.01。圖3 轉(zhuǎn)染miR-760對A549細胞系惡性生物學行為的影響

注：A. BATF3 與miR-760的3＇UTR可能存在結(jié)合位點；B. BATF3與miR-760的3＇UTR結(jié)合位點；C. WT BATF3 3＇UTR和Mut BATF3 3＇UTR與miR-760的結(jié)合情況；D. miR-760 mimics轉(zhuǎn)染A549細胞后對 BATF3蛋白表達的影響。與miR-760 NC組相比，**P<0.01。圖4 BATF3是NSCLC細胞中miR-760的靶基因

2.5 miR-760靶向BATF3影響NSCLC細胞的惡性生物學行為將pcDNA3.1-BATF3轉(zhuǎn)染至A549細胞，Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)BATF3蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.01，圖5A)。經(jīng)miR-760 mimics轉(zhuǎn)染和pcDNA3.1-BATF3共轉(zhuǎn)染，過表達BATF3顯著促進了miR-760 mimics誘導的A549細胞的增殖和遷移(均P<0.01，圖5B、5C)，即miR-760與BATF3協(xié)同作用促進了NSCLC細胞的增殖和遷移。

注：A. pcDNA3.1-BATF3轉(zhuǎn)染組與空白對照組BATF3蛋白的表達水平；B. BATF3轉(zhuǎn)染對A549細胞增殖的影響；C. BATF3轉(zhuǎn)染對A549細胞遷移的影響(結(jié)晶紫染色，×400)。與空白對照組相比，**P<0.01； 與miR-760 mimics+空白載體組相比， ##P<0.01。圖5 miR-760靶向BATF3影響NSCLC細胞的惡性生物學行為

3 討論

肺癌是國內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，也是導致腫瘤相關(guān)死亡的主要原因之一[18]。NSCLC是肺癌中發(fā)生率和死亡率最高的腫瘤類型，許多患者在發(fā)現(xiàn)時已為晚期[19]。目前，肺癌的治療手段主要是手術(shù)治療輔以化療，但患者的預后很差[20]。所以，提高患者早期診斷率、生存率和預后效果是亟待解決的問題，這迫切需要厘清NSCLC的發(fā)生發(fā)展分子機制。

miRNA除了參與細胞正常的生理過程，還參與腫瘤細胞的病理過程[21]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-10a/b在髓系分化和急性髓系白血病的發(fā)生中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[8]，miR-140在結(jié)直腸癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮抑制作用[9]。miR-760是miRNA家族的重要成員，其異常表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織中miR-760的表達量顯著低于癌旁組織(P<0.01)，這與Yan等[22]的研究結(jié)果一致，提示miR-760的異常低表達與NSCLC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miR-760表達升高顯著抑制NSCLC細胞系A(chǔ)549的增殖與遷移(均P<0.01)。

研究發(fā)現(xiàn)，BATF-/-小鼠Th17缺乏，并且對通常誘發(fā)類似多發(fā)性硬化癥的自身免疫條件具有抵抗力[23]。BATF3是BATF家族的重要成員，研究發(fā)現(xiàn)BATF3的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[24-25]。本研究通過檢測NSCLC組織與癌旁組織BATF3的表達發(fā)現(xiàn)，腫瘤組織BATF3的表達量顯著高于癌旁組織(P<0.01)；檢測NSCLC細胞與正常肺上皮細胞發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞BATF3的表達量顯著高于正常細胞(均P<0.01)，這與Cao等[26]的研究結(jié)果一致，提示BATF3的異常高表達參與NSCLC的發(fā)生發(fā)展過程。

研究發(fā)現(xiàn)miR-150通過靶向PDCD4促進宮頸癌細胞的惡性發(fā)展[10]；miR-1179通過靶向精子相關(guān)抗原5介導的AKT信號通路抑制人NSCLC細胞的生長和侵襲[11]；miR-760通過靶向BATF3/AP-1/CyclinD1信號通路抑制人結(jié)直腸癌細胞的生長[26]。本研究通過質(zhì)粒構(gòu)建和熒光素酶報告基因?qū)嶒灠l(fā)現(xiàn)，BATF3是miR-760的直接靶點；進一步將pcDNA3.1-BATF3轉(zhuǎn)染至A549細胞，發(fā)現(xiàn)BATF3蛋白表達顯著上調(diào)(P<0.01)；A549細胞經(jīng)miR-760 mimics轉(zhuǎn)染和pcDNA3.1-BATF3共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)過表達BATF3促進miR-760 mimics誘導的A549細胞的增殖和遷移，提示miR-760通過與BATF3互作抑制NSCLC細胞的增殖和遷移，即miR-760靶向BATF3調(diào)控NSCLC細胞系A(chǔ)549的惡性發(fā)展。

綜上所述，miR-760在NSCLC組織與細胞系中低表達；BATF3在NSCLC組織與細胞系中高表達；miR-760的過表達能抑制NSCLC組織中BATF3的表達，miR-760靶向BATF3調(diào)控NSCLC細胞的惡性生物學行為。以上研究提示BATF3未來可能作為NSCLC的治療靶標。