異丙酚抑制甲?；氖荏w1減輕膿毒癥誘導的小鼠急性肺損傷

李成潔，陳健，吳勇，陳愛鸞，沈伯雄

(1. 海南西部中心醫(yī)院 麻醉科，儋州 571700；2. 上海第九人民醫(yī)院 麻醉科，上海 200011)

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是臨床病情危重患者的常見并發(fā)癥[1]。2018年美國重癥醫(yī)學會公布的危重患者管理方案建議，對此類患者應盡量減少連續(xù)或間歇性鎮(zhèn)靜[2]。然而，對患氣道過敏危重病的患者，需要使用鎮(zhèn)靜劑擴張支氣管并盡量減少其應激反應。異丙酚是最常用的靜脈麻醉藥物之一，主要用于麻醉的誘導和維持以及重癥監(jiān)護室的鎮(zhèn)靜治療。近年來研究發(fā)現(xiàn)異丙酚具有抑炎作用，如抑制單核/巨噬細胞和中性粒細胞的免疫活性，抑制促炎細胞因子的產生并減少一氧化氮的生物合成[3-4]。這一抑炎特性可能有利于危重患者ALI病情的緩解。然而，異丙酚發(fā)揮抑炎作用的機制尚不清楚。線粒體來源的N-甲?；脑诮M織或細胞損傷后迅速被釋放；該分子是強化學誘導劑，能夠激活甲?；氖荏w1(formyl peptide receptor 1，F(xiàn)PR1)并觸發(fā)免疫細胞的多種功能，包括趨化、脫顆粒、活性氧類生成和吞噬作用，引發(fā)和加重炎癥反應[5]。以往研究表明，異丙酚是N-甲?；牡母偁幮砸种苿?，通過阻斷FPR1發(fā)揮作用，但尚不清楚異丙酚是否通過阻斷FPR1改善危重患者的ALI病情[6]。本研究中，我們假設異丙酚通過抑制內源性N-甲?；恼T導的炎癥反應改善危重癥患者的肺部損傷。為驗證該假設，研究探討了異丙酚在膿毒癥誘導的ALI小鼠模型中的保護作用，并通過體外試驗觀察異丙酚對FPR1激動劑誘導的人中性粒細胞活化的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 樣本、材料、藥品、試劑與儀器12例健康體檢受試者靜脈血，采集自海南西部中心醫(yī)院。SPF級BALB/c小鼠(40只，雄性，體質量20～25 g，7～8周齡)，購自廣東省醫(yī)學實驗動物中心。異丙酚粉末(2，6-二異丙基苯酚)，購自Sigma-Aldrich公司。兔抗鼠磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、磷酸化p38促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)抗體和山羊抗兔IgG-HRP二抗，均購自CST公司。兔抗鼠FPR1和Ly6G抗體，購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)測定試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。TNF-α、CXCL1、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒及N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLF，F(xiàn)PR1激動劑)，購自R&D SYSTEMS公司。N-甲氧基琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-纈氨酸對硝基酰苯胺[L-Valinamide， N-(4-methoxy-1， 4-dioxobutyl)-L-alanyl-L-alanyl-L-prolyl-N-(4-nitrophenyl)， N-Methoxysuccinyl-ala-ala-pro-val4-nitroanilide]，購自Tocris Bioscience公司。Western blotting檢測試劑，購自安瑪西亞中國有限公司。所有其他試劑均購自Sigma-Aldrich公司。BX51顯微鏡，來自奧林巴斯(中國)有限公司；UV-2700雙光束紫外分光光度計，來自島津公司。

1.2 小鼠LPS誘導膿毒癥模型的建立于25 ℃恒溫環(huán)境飼養(yǎng)小鼠，自由飲食飲水并給予12 h/12 h晝夜明暗交替。適應性飼養(yǎng)小鼠1周后進行實驗。將實驗小鼠隨機分為4組，每組10只：1組為用50 μL 10% 二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)處理的假手術(sham)小鼠；2組為用50 μL異丙酚(40 mg/kg)處理的假手術小鼠；3組為用50 μL 10% DMSO處理的膿毒癥小鼠；4組為用50 μL異丙酚(40 mg/kg)處理的膿毒癥小鼠。將異丙酚粉末溶解于DMSO，后用生理鹽水稀釋。模型組小鼠每隔30 min腹腔注射1次DMSO或異丙酚，共治療3次。第2次注射DMSO或異丙酚后，經(jīng)腹腔單次注射200 μL LPS(10 mg/kg，提取自大腸埃希菌，血清型：O111：B4)或相同體積0.9%生理鹽水(假手術組)。膿毒癥模型鼠于注射LPS后20 h處死。固定小鼠，取右肺上葉2段于10%中性福爾馬林中固定；制備石蠟組織塊并切5 μm薄片，進行H-E和免疫組織化學染色。在生存研究中，每組設6只小鼠，膿毒癥小鼠接受單劑量200 μL LPS(10 mg/kg)腹腔注射建模，同時治療組給予腹腔注射50 μL異丙酚(設2個劑量：20或40 mg/kg)，連續(xù)監(jiān)測7 d并統(tǒng)計小鼠的生存率。

1.3 H-E和免疫組織化學染色石蠟切片常規(guī)脫蠟，用3%過氧化氫孵育10 min滅活內源性過氧化物酶。于室溫條件用山羊血清封閉切片15 min，后用蒸餾水和PBS各漂洗3次。于4 ℃條件下用抗FPR1抗體(1∶150)、抗Ly6G抗體(1∶150)過夜孵育切片，后用PBS漂洗2次。于室溫條件下將切片與山羊抗兔IgG-HRP抗體(1∶500)共孵育20 min。PBS漂洗3次后，用二氨基聯(lián)苯胺染色，蘇木精復染。在BX51顯微鏡下觀察切片及攝片，并用Image Pro Plus v6.0分析圖像。

1.4 各組小鼠肺組織MPO活性的測定研究以肺組織中MPO活性作為中性粒細胞聚積數(shù)的衡量指標，用于評估肺組織中中性粒細胞的浸潤情況。使用玻璃勻漿器在冷藏的pH值7.4的磷酸鉀緩沖溶液中勻漿肺組織(使質量體積濃度為10%)。于4 ℃條件下以10 000×g離心勻漿20 min，收集上清液。使用MPO測定試劑盒評估肺組織中MPO的活性。所有步驟均按試劑盒說明書進行。

1.5 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)的分析于室溫條件下向分離自每只大鼠的左肺支氣管中注射0.5 mL PBS，反復抽吸3次后，收集BALF，重復操作3次，保證每次樣本回收率超過80%。于4 ℃條件下按1 200×g離心BALF 10 min。將上清液分成小份(0.1 mL/份)，并于-70 ℃條件下保存，以便通過ELISA批量分析樣本。使用小鼠TNF-α、CXCL1、IL-1β和IL-6 ELISA檢測試劑盒檢測BALF樣本中TNF-α、CXCL1、IL-1β和IL-6水平。

1.6 人中性粒細胞樣本的制備自20～30歲健康受試者捐獻的肝素化靜脈血(每位受試者取50 mL外周血)分離人中性粒細胞(受試者于采血前1周內未報告有全身性疾病)。根據(jù)文獻[7]報道的方法分離人中性粒細胞。采用Ficoll密度梯度離心法離心血液樣本，用低滲溶血法去除混雜的紅細胞。實驗前，將分離的中性粒細胞懸浮于pH值7.4的含Ca2+Hank＇s平衡鹽溶液中，于4 ℃條件下保存。通過瑞氏-吉姆薩染色確定中性粒細胞懸液的純度，經(jīng)臺盼藍染色鑒定得細胞存活率>98%。

1.7 人中性粒細胞超氧陰離子釋放的檢測本研究使用可被超氧化物還原的鐵細胞色素c評估人中性粒細胞中的超氧化物釋放情況。將分離的中性粒細胞懸液(6×105個/mL)接種于含鐵細胞色素c(0.5 mg/mL)和CaCl2(1 mmol/L)的Hank＇s平衡鹽溶液中，添加DMSO或異丙酚(5～100 μmol/L)處理5 min。然后加入fMLF(30 nmol/L)活化中性粒細胞。用UV-2700雙光束紫外分光光度計連續(xù)監(jiān)測鐵細胞色素c還原引起的光密度[D(550 nm)]值的變化。超氧化物釋放量的計算公式為：超氧化物釋放量=[D(550 nm)含超氧化物歧化酶(100 U/mL)的反應-D(550 nm)無超氧化物歧化酶的反應]/ε還原形式鐵細胞色素c的消光系數(shù)[8]。

1.8 人中性粒細胞彈性蛋白酶釋放的檢測本研究通過檢測彈性蛋白酶釋放評估活化中性粒細胞的脫顆粒情況。以N-甲氧基琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-脯酰氨-纈氨酸對硝基酰苯胺為彈性蛋白酶底物，將人中性粒細胞懸液(6×105個/mL)與底物(0.1 mmol/L)加入含CaCl2(1 mmol/L)的Hank＇s平衡鹽溶液中，添加DMSO或異丙酚(5～100 μmol/L)處理5 min，然后加入fMLF(30 nmol/L)活化中性粒細胞。使用UV-2700雙光束紫外分光光度計連續(xù)監(jiān)測D(405 nm)值的變化[8]。

1.9 Western blotting檢測人中性粒細胞MAPK信號通路蛋白的表達用10%DMSO或異丙酚(50 μmol/L)處理人中性粒細胞5 min，添加fMLF(30 nmol/L)激動30 s，后將細胞置于冰上終止反應。于培養(yǎng)液中加入含有NaCl(100 mmol/L)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)(1 mmol/L)、HEPES(50 mmol/L、pH值7.4)、Na3VO4(釩酸鈉，2 mmol/L)、對硝基苯基磷酸酯(10 mmol/L)、5% 2-巰基乙醇、苯甲磺酰氟化物(1 mmol/L)、1%蛋白酶抑制劑和1% Triton X-100的裂解緩沖液。于冰浴中采用超聲波細胞破碎儀勻漿細胞，具體為超聲5 s，停3 s，如此循環(huán)3～5次。于4 ℃條件下14 000×g離心20 min，收集上清液。通過SDS-PAGE將分離的蛋白質轉移至硝酸纖維素(nitrocellulose, NC)膜上，后用5%脫脂奶粉溶液封閉膜2 h，共孵育NC膜與山羊抗兔IgG-HRP。將Western blotting系統(tǒng)添加至NC膜，使用ImageJ軟件分析條帶灰度。

2 結果

2.1 異丙酚減輕膿毒癥小鼠ALI并提高其存活率H-E染色結果顯示，膿毒癥誘導的ALI小鼠肺組織出現(xiàn)明顯的病理改變如肺水腫、肺泡出血、肺泡壁增厚和炎癥細胞浸潤；然而，腹腔注射異丙酚緩解了肺組織的上述病理改變。免疫組織化學染色結果顯示，膿毒癥增加了小鼠肺組織FPR1和Ly6G蛋白表達，表明中性粒細胞浸潤增加，而腹腔注射異丙酚可有效減少肺部因炎癥引起的中性粒細胞浸潤增加(圖1B、1C)。此外，MPO活性是中性粒細胞浸潤程度的定量指標，在膿毒癥小鼠的肺組織中顯著增加(P<0.001，圖1D)；腹腔注射異丙酚則顯著抑制了膿毒癥小鼠肺部MPO活性的升高(P<0.01，圖1D)。生存研究中，LPS注射后3 d內，本組小鼠存活率為0(圖1E)。相比之下，LPS注射后87.5%(7/8)接受異丙酚(40 mg/kg)治療的小鼠存活時間達7 d(圖1E)。

注：A. 各組小鼠肺組織H-E染色(×200)；B. 各組小鼠免疫組織化學染色分析肺組織中FPR1蛋白表達水平(×200)；C. 各組小鼠免疫組織化學染色分析肺組織中Ly6G蛋白表達水平(×400)；D. 各組小鼠肺組織中MPO活性的測定；E. 各組小鼠的Kaplan-Meier生存曲線分析。與假手術組相比，***P<0.001；與LPS組相比，##P<0.01。圖1 異丙酚對膿毒癥誘導ALI小鼠肺部損傷及存活率的影響

表1 異丙酚對膿毒癥小鼠ALI模型BALF中炎性因子水平的影響

2.2 異丙酚抑制小鼠BALF中炎性因子的表達膿毒癥小鼠BALF中TNF-α、IL-1β、IL-6和CXCL1表達水平顯著增加(均P<0.01)，而腹腔注射異丙酚顯著抑制了膿毒癥小鼠BALF中上述細胞因子表達水平的升高(均P<0.05)。

2.3 異丙酚抑制fMLF誘導的人中性粒細胞彈性蛋白酶和超氧化物的釋放中性粒細胞產生的超氧陰離子和彈性蛋白酶是殺死病原體的重要成分，其中涉及許多病理反應[9]。研究評估了異丙酚對中性粒細胞胞外彈性蛋白酶活化和超氧陰離子釋放的影響。結果表明，異丙酚(5～100 μmol/L)劑量依賴性地降低彈性蛋白酶活性和超氧化物釋放(均P<0.05，表2)。此外，異丙酚預處理使fMLF釋放彈性蛋白酶和產生超氧陰離子的濃度響應曲線右移(圖2A、2B)，提示異丙酚可能是FPR1的抑制劑。

表2 異丙酚對fMLF誘導的人中性粒細胞彈性蛋白酶活性和超氧化物釋放的影響

注：A. 異丙酚對fMLF作用下中性粒細胞彈性蛋白酶活性的影響；B. 異丙酚對fMLF作用下中性粒細胞超氧化物釋放量的影響。與DMSO組相比，**P<0.01，***P<0.001。圖2 異丙酚對fMLF作用下中性粒細胞彈性蛋白酶活性及超氧化物釋放的影響

2.4 異丙酚抑制fMLF誘導的人中性粒細胞MAPK信號通路蛋白磷酸化水平MAPK信號途徑參與了FPR1下游信號通路的轉導[10]。Western blotting檢測結果示異丙酚顯著減少了fMLF誘導的人中性粒細胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化水平(均P<0.001,圖3)。

注：A. 各組人中性粒細胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化蛋白表達的Western blotting分析圖；B. 各組人中性粒細胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化水平的定量分析。與空白對照組相比，***P<0.001；與fMLF組相比，###P<0.001。圖3 Western blotting檢測異丙酚對fMLF誘導的人中性粒細胞ERK、p38 MAPK和JNK磷酸化水平的影響

3 討論

異丙酚常用于危重癥患者的鎮(zhèn)靜治療。許多臨床試驗表明，異丙酚具有良好的抗氧化、抑炎、抗自由基等生物學作用[3-4]。據(jù)報道，異丙酚能有效降低患者術后認知功能障礙的發(fā)生率，維持機體適當?shù)难鲃恿W狀態(tài)，縮短患者重癥監(jiān)護病房的住院時間并提高大手術或心肺轉流術患者的肺順應性[11-12]。然而，異丙酚保護作用的詳細分子機制仍不完全清楚。本研究中，異丙酚治療顯著改善了膿毒癥誘導的小鼠肺部炎癥反應和組織病理學改變，減少了肺部FPR1蛋白水平及中性粒細胞浸潤。結果表明，異丙酚對膿毒癥誘導的ALI小鼠肺部的保護作用可能與抑制FPR1上調有關。

越來越多的證據(jù)表明，中性粒細胞的積聚和活化是ALI的1個關鍵過程[13]。激活的人中性粒細胞可能通過增加炎癥介質釋放加重肺組織損傷，從而導致內皮功能障礙和氣道重塑[14]。多種炎性介質，包括TNF-α、IL-1β和趨化因子，已被證明在ALI病程中參與上皮和內皮屏障的破壞。TNF-α、IL-1β、IL-6和CXC趨化因子家族的釋放與中性粒細胞募集相關，并與ALI的嚴重程度和死亡率相關[15]。本研究中，異丙酚的應用可顯著減少小鼠肺部炎性介質的產生，與其他顯示異丙酚在各種體內外模型中具有抑炎作用的結論一致[16-17]。進一步的研究中，筆者發(fā)現(xiàn)異丙酚減少了膿毒癥誘導的ALI小鼠肺部Ly6G蛋白水平，并且體外試驗證明了其通過阻斷FPR1抑制了fMLF誘導的中性粒細胞激活。FPR1是G蛋白偶聯(lián)的7種跨膜受體之一，在炎癥反應中發(fā)揮重要作用[18]。N-甲酰肽由細菌產生，或釋放自損傷的線粒體，可通過與FPR1的結合刺激免疫細胞觸發(fā)炎癥反應[5]。研究發(fā)現(xiàn)，來自肝細胞線粒體的N-甲?；淖饔糜贔PR1以觸發(fā)趨化反應并誘導呼吸爆發(fā)[19]。線粒體產生的N-甲?；目杉せ钪行粤＜毎?，在Ca2+和ERK的作用下釋放基質金屬蛋白酶9和IL-8，并在肺組織中誘導炎癥反應[20]。fMLF是1種釋放自受損細胞線粒體的衍生的N-甲?；?，趨化FPR陽性白細胞向炎癥部位浸潤，參與誘導組織的早期損傷。本研究通過fMLF檢測FPR1相關的中性粒細胞炎癥反應情況。結果表明，異丙酚對fMLF激活的人中性粒細胞的超氧陰離子生成和彈性蛋白酶釋放均有明顯的抑制作用，表明異丙酚通過抑制中性粒細胞激活發(fā)揮抑炎作用。

此外，p38和ERK-MAPK是FPR1信號通路的下游介質，它們在FPR1激動劑作用于中性粒細胞時被強烈激活[21]。在小鼠膿毒癥模型中，p38激活促進中性粒細胞的趨化性遷移；MAPK ERK/JNK激活誘發(fā)肺部炎癥反應，導致肺損傷[18]。本研究通過Western blotting檢測發(fā)現(xiàn)，異丙酚降低了fMLF誘導的ERK、p38和JNK磷酸化水平。上述結果表明，異丙酚可直接干擾fMLF與FPR1的相互作用，阻斷下游信號通路，從而有效降低fMLF誘導的人中性粒細胞炎癥反應水平。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，在以膿毒癥為特征的小鼠ALI模型中，異丙酚給藥改善了其肺功能，減輕了肺損傷，并下調了FPR1和Ly6G表達。進一步體外試驗證實，異丙酚對fMLF誘導的人中性粒細胞活化的抑制作用是通過與FPR1結合介導的，具體是抑制了FPR1下游信號轉導和炎癥反應發(fā)生，如超氧化物和彈性蛋白酶的釋放。因此，異丙酚可能對治療患有膿毒癥和膿毒癥相關ALI的重癥患者有實用價值。