不同發(fā)病狀態(tài)的潰瘍性結(jié)腸炎患者血清炎癥因子和免疫球蛋白變化及與腸道菌群變化的相關(guān)性*

高磊，張英劍，劉曉敏，曹蕾，王瑞芳，薛娟

河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院 1消化內(nèi)科，2內(nèi)鏡中心，3檢驗(yàn)科（河南洛陽(yáng)471000）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是由腸道微生態(tài)改變、免疫調(diào)節(jié)異常、炎癥反應(yīng)等多種因素誘發(fā)的慢性炎癥性腸道疾病，臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、便血等癥狀，病灶多位于大腸，可累及直腸及遠(yuǎn)端結(jié)腸，并呈連續(xù)彌漫性分布，病情反復(fù)發(fā)作、遷延難愈，嚴(yán)重影響患者的身心健康［1－2］。人體腸道內(nèi)存在種類繁多、數(shù)量巨大的細(xì)菌群體，在正確情況下參與腸道內(nèi)分解、代謝，維持腸道內(nèi)免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定［3］。研究表明，人體腸道菌群發(fā)生失衡，腸道細(xì)菌出現(xiàn)移位，進(jìn)入人體微循環(huán)，誘發(fā)全身炎性反應(yīng)和自身免疫異常，造成級(jí)聯(lián)性免疫反應(yīng)細(xì)胞凋亡，致使炎癥持續(xù)反復(fù)發(fā)作，惡化病情［4］。經(jīng)大量研究證實(shí)，機(jī)體免疫系統(tǒng)失衡、腸道菌群紊亂及細(xì)胞炎性反應(yīng)是誘發(fā)UC的關(guān)鍵病理過(guò)程，也是UC反復(fù)發(fā)作、甚至炎癌轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制［5－7］。徐寶琪等［7］研究表明，UC患者不同病情階段，其機(jī)體炎癥反應(yīng)、免疫球蛋白水平及與腸道菌群數(shù)量也不盡相同。本研究通過(guò)檢測(cè)不同發(fā)病狀態(tài)UC患者的血清炎癥因子、免疫球蛋白及腸道菌群變化，進(jìn)一步分析其相關(guān)性，為UC的臨床治療提供參考，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019年6月至2020年5月我院收治的UC患者90例作為研究對(duì)象。診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)（2018年）》進(jìn)行診斷［8］；（1）有腹痛、腹瀉及黏液膿血便，呈持續(xù)、反復(fù)發(fā)作狀態(tài)；（2）結(jié)腸鏡下見(jiàn)黏膜血管紋理模糊或紊亂、充血、水腫，有膿性分泌物附著，病變處見(jiàn)明顯多發(fā)性潰瘍或彌漫性糜爛。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）均經(jīng)病史、臨床癥狀、電子腸鏡及病理組織學(xué)確診，符合《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)（2018年）》中UC的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）病程＞4周；（3）近1個(gè)月未接受激素、益生菌、抗菌藥物及免疫抑制劑等藥物治療；（4）年齡18～80歲；（5）臨床診療資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴自身免疫性疾病者；（2）伴血液系統(tǒng)疾病者；（3）伴慢性肝腎疾病者；（4）伴嚴(yán)重心、腦、肺疾病者；（5）伴有克羅恩病等其他腸道疾病者；（6）伴有細(xì)菌型痢疾、腸結(jié)核等感染性結(jié)腸炎者；（7）存在精神疾病或意識(shí)障礙者；（8）入組前1個(gè)月有益生元、膳食纖維等攝入史者；（9）存在腸癌家族史者；（10）妊娠期、哺乳期婦女；（11）中途退出研究者。根據(jù)患者不同發(fā)病狀態(tài)，將其分為急性組（n＝30）、慢性復(fù)發(fā)組（n＝30）、慢性持續(xù)組（n＝30），另取同時(shí)間段內(nèi)健康體檢者30例為對(duì)照組。各組一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則，且已經(jīng)我院醫(yī)院倫理委員會(huì)審批同意，患者或其家屬均已簽署知情同意書(shū)。

表1 各組一般資料比較 ±s

表1 各組一般資料比較 ±s

項(xiàng)目 例數(shù) 性別（例）男 女 年齡（歲） 病程（年）急性組30 17 13 42.34±8.49 2.43±0.61慢性復(fù)發(fā)組 30 16 14 43.48±7.20 2.47±0.55慢性持續(xù)組 30 15 15 42.95±9.11 2.49±0.59對(duì)照組 30 16 14 42.88±10.42 F／χ2值 0.628 1.432 0.851 P值0.311 0.076 0.127

1.2 方法

1.2.1 樣本采集與預(yù)處理 采集各組受試者的清晨空腹?fàn)顟B(tài)下的肘靜脈血8 mL置于10 mL EP管中，靜置30 min，經(jīng)TDZ4－WS自動(dòng)脫帽離心機(jī)（長(zhǎng)沙維爾康湘鷹離心機(jī)有限公司）離心15 min，離心半徑為11 cm，速度為3 000 r／min，分離上層血清置于5 mL EP管中，置于－70℃冰箱中保持待檢。采集各組受試者的新鮮糞便標(biāo)本1.5 g置于試劑瓶中，加入4.5 mL稀釋液稀釋，經(jīng)MX－S型旋渦混勻儀（美國(guó)scilogex公司）在3 000 r／min速度下震蕩1 min，稀釋10倍后平均置于不同試劑瓶中，取10μL接種于培養(yǎng)基中置于30℃環(huán)境下保存待檢，培養(yǎng)基購(gòu)自上海中信國(guó)建藥業(yè)股份有限公司。

1.2.2 血清炎癥因子檢測(cè) 采用酶連免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測(cè)各組受試者的炎癥因子基質(zhì)金屬蛋白酶－1（matrix metalloproteinase 1，MMP－1）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（transforming growth factor beta，TGF－β）、高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）、β干擾素（interferon－β，IFN－β）、可溶性白細(xì)胞介素－2受體（soluble interleukin－2 receptor，sIL－2R）水平，采用美國(guó)Molecular Devices Flexstation 3酶標(biāo)儀（美國(guó)RD公司），ELISA試劑盒均購(gòu)自上海森雄生物技術(shù)公司，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.3 血清免疫球蛋白檢測(cè) 采用免疫比濁法檢測(cè)各組血清免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）水平，所用儀器為Array 360 System血清免疫球蛋白分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司），使用儀器配套試劑盒，檢測(cè)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4 腸道菌群檢測(cè) 培養(yǎng)2～3 d后，由檢驗(yàn)科專業(yè)人員初篩后采用VITEK－2 Compact型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀對(duì)雙歧桿菌、乳桿菌、腸桿菌、腸球菌給予活菌計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)；血清MMP－1、TGF－β、HMGB1等計(jì)量資料以±s表示，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)與方差齊性檢驗(yàn)后正態(tài)分布且方差齊性的計(jì)量資料，兩組間比較行重復(fù)測(cè)量方差分析，多組比較行單因素方差分析，采用Pearson檢驗(yàn)分析患者血清炎癥因子與免疫球蛋白與腸道菌群的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)病狀態(tài)UC患者與對(duì)照組血清炎癥因子水平比較 UC患者血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平均明顯高于對(duì)照組，IFN－β水平明顯低于對(duì)照組；急性組患者血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平均明顯高于慢性復(fù)發(fā)組、慢性持續(xù)組，IFN－β水平明顯低于慢性復(fù)發(fā)組、慢性持續(xù)組；慢性復(fù)發(fā)組患者血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平均明顯高于慢性持續(xù)組，IFN－β水平明顯低于慢性持續(xù)組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同發(fā)病狀態(tài)UC患者與對(duì)照組血清炎癥因子水平比較 ±s

表2 不同發(fā)病狀態(tài)UC患者與對(duì)照組血清炎癥因子水平比較 ±s

注：*與對(duì)照組比較P＜0.05；△與慢性復(fù)發(fā)組比較P＜0.05；▲與慢性持續(xù)組比較P＜0.05

項(xiàng)目 例數(shù) MMP－1（μg／L） TGF－β（pg／mL） HMGB1（ng／L） IFN－β（pg／mL） sIL－2R（U／mL）急性組 30 2.91±0.35*△▲ 25.38±6.92*△▲ 289.96±16.15*△▲ 30.33±4.21*△▲ 442.95±26.08*△▲慢性復(fù)發(fā)組 30 2.55±0.30*▲ 19.10±4.87*▲ 217.03±13.92*▲ 41.64±6.76*▲ 371.23±20.69*▲慢性持續(xù)組 30 2.12±0.27*△ 13.85±4.21*△ 152.54±12.68*△ 55.78±7.30*△ 353.52±16.75*△對(duì)照組 30 0.64±0.21 4.27±1.05 94.41±9.26 69.46±7.85 97.21±7.04 F值 24.026 29.931 57.070 35.183 62.235 P值0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

2.2 不同發(fā)病狀態(tài)UC患者與對(duì)照組血清免疫球蛋白水平比較 UC患者血清IgA、IgM水平均明顯低于對(duì)照組，急性組患者血清IgA、IgM水平均明顯低于慢性復(fù)發(fā)組、慢性持續(xù)組，慢性復(fù)發(fā)組患者血清IgA、IgM水平均明顯低于慢性持續(xù)組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 不同發(fā)病狀態(tài)UC患者與對(duì)照組血清免疫球蛋白水平比較 （±s）g／L

表3 不同發(fā)病狀態(tài)UC患者與對(duì)照組血清免疫球蛋白水平比較 （±s）g／L

注：*與對(duì)照組比較P＜0.05；△與慢性復(fù)發(fā)組比較P＜0.05；▲與慢性持續(xù)組比較P＜0.05

項(xiàng)目 例數(shù)IgA IgM IgG急性組 30 2.01±0.17*△▲ 0.69±0.09*△▲ 12.66±0.64*△▲慢性復(fù)發(fā)組 30 2.23±0.21*▲ 0.84±0.11*▲ 12.61±0.72*▲慢性持續(xù)組 30 2.45±0.24*△ 0.98±0.13*△ 12.63±0.67*△對(duì)照組 30 2.57±0.16 1.48±0.15 13.13±0.93 F值 11.984 29.241 0.427 P值0.000 0.000 0.551

2.3 不同發(fā)病狀態(tài)UC患者與對(duì)照組腸道菌群比較 UC患者雙歧桿菌株數(shù)、乳桿菌株數(shù)明顯低于對(duì)照組，腸桿菌株數(shù)、腸球菌株數(shù)明顯高于對(duì)照組；急性組雙歧桿菌株數(shù)、乳桿菌株數(shù)明顯低于慢性復(fù)發(fā)組、慢性持續(xù)組，腸桿菌株數(shù)、腸球菌株數(shù)明顯高于慢性復(fù)發(fā)組、慢性持續(xù)組；慢性復(fù)發(fā)組雙歧桿菌株數(shù)、乳桿菌株數(shù)明顯低于慢性持續(xù)組，腸桿菌株數(shù)、腸球菌株數(shù)明顯高于慢性持續(xù)組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 不同發(fā)病狀態(tài)UC患者與對(duì)照組腸道菌群比較 （±s）CFU／g

表4 不同發(fā)病狀態(tài)UC患者與對(duì)照組腸道菌群比較 （±s）CFU／g

注：*與對(duì)照組比較P＜0.05；△與慢性復(fù)發(fā)組比較P＜0.05；▲與慢性持續(xù)組比較P＜0.05

項(xiàng)目 例數(shù) 雙歧桿菌 乳桿菌 腸桿菌 腸球菌急性組 30 6.43±0.13*△▲ 7.03±0.15*△▲ 11.94±0.47*△▲ 8.64±0.32*△▲慢性復(fù)發(fā)組 30 7.63±0.17*▲ 7.82±0.19*▲ 10.48±0.32*▲ 8.05±0.24*▲慢性持續(xù)組 30 8.44±0.20*△ 8.37±0.22*△ 8.93±0.25*△ 7.57±0.19*△對(duì)照組 30 9.77±0.35 9.91±0.31 7.92±0.14 7.06±0.16 F值 13.714 10.085 9.792 8.814 P值0.000 0.000 0.000 0.000

2.4 UC患者血清炎癥因子與免疫球蛋白與腸道菌群的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示：UC患者腸桿菌株數(shù)、腸球菌株數(shù)與血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R 水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與血清IFN－β水平呈正相關(guān)（P＜0.05）；血清IgA、IgM水平及雙歧桿菌株數(shù)、乳桿菌株數(shù)與血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平呈正相關(guān)（P＜0.05），與血清IFN－β水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 UC患者血清炎癥因子與免疫球蛋白與腸道菌群的相關(guān)性分析

3 討論

UC是由腸道細(xì)菌激活所形成的異常免疫反應(yīng)，造成細(xì)胞炎性反應(yīng)增強(qiáng)，當(dāng)炎性反應(yīng)過(guò)度超過(guò)機(jī)體組織耐受度，會(huì)對(duì)靶器官造成損傷，導(dǎo)致功能障礙，進(jìn)而發(fā)生結(jié)腸炎性變化［9］。正常情況下人體腸道內(nèi)存在大量不同腫瘤的細(xì)菌，主要集中在結(jié)腸和小腸末端，主要包括人體共生菌、機(jī)會(huì)致病菌、病原菌3種［10］。腸桿菌、腸球菌屬于機(jī)會(huì)致病菌，也被稱為非優(yōu)勢(shì)菌群，通常情況下人體腸道內(nèi)含量較少，當(dāng)機(jī)體免疫功能下降時(shí)便會(huì)大量繁殖［11］。雙歧桿菌、乳桿菌屬于人體共生細(xì)菌，又被稱為腸道優(yōu)勢(shì)菌群，具有調(diào)節(jié)免疫功能、分解、代謝等作用，能夠?qū)箼C(jī)會(huì)致病菌對(duì)人體腸黏膜的侵入［12］。正常情況下人體腸道內(nèi)腸道菌群按照一定的比例共存并形成腸道生態(tài)平衡，當(dāng)腸道菌群失調(diào)，會(huì)導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)異常免疫反應(yīng)，使得機(jī)會(huì)致病菌大量繁殖并不斷增強(qiáng)侵襲力，破壞腸道黏膜屏障，引起機(jī)體腸黏膜反應(yīng)［13］。本研究結(jié)果顯示，UC患者雙歧桿菌株數(shù)、乳桿菌株數(shù)明顯低于對(duì)照組，腸桿菌株數(shù)、腸球菌株數(shù)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。提示，與健康人群相比，UC患者有嚴(yán)重腸道菌群失調(diào)，具體表現(xiàn)為機(jī)會(huì)致病菌腸桿菌和腸球菌計(jì)數(shù)明顯增加，而雙歧桿菌和乳桿菌等益生菌合成減少，是造成腸黏膜損傷的重要原因之一，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道［14－15］基本一致。筆者發(fā)現(xiàn)，UC患者中急性組、慢性復(fù)發(fā)組、慢性持續(xù)組雙歧桿菌株數(shù)、乳桿菌株數(shù)均依次降低，腸桿菌株數(shù)、腸球菌株數(shù)均依次升高（P＜0.05）。提示急性期UC患者的腸道菌群紊亂更嚴(yán)重，細(xì)菌感染風(fēng)險(xiǎn)更高，病情更為嚴(yán)重。

UC主要病理特征為腸黏膜慢性炎癥損傷，炎癥反應(yīng)參與UC發(fā)生發(fā)展。正常情況下腸道內(nèi)人體共生菌會(huì)通過(guò)激活胃腸道黏膜固有層巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞上Toll受體以激活T淋巴細(xì)胞，產(chǎn)生抗炎因子以誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)菌群免疫耐受［16］。sIL－2R是一種重要的免疫抑制劑，可中和活化T細(xì)胞周圍的白細(xì)胞介素－2，減弱機(jī)體的內(nèi)分泌效應(yīng)，抑制已活化的T細(xì)胞的克隆化擴(kuò)增，發(fā)揮正反免疫調(diào)節(jié)作用［17］。HMGB1是一種重要的晚期致炎因子，受到TLR2調(diào)節(jié)，參與炎癥過(guò)程中的神經(jīng)－內(nèi)分泌免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，可激活單核巨噬細(xì)胞并釋放多種促炎因子，發(fā)揮致炎作用［18］。IFN－β為典型的抑炎因子，可抑制單核巨噬細(xì)胞功能以發(fā)揮抗炎作用，其表達(dá)增加則可抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)過(guò)度加?。?9］。正確情況下人體中MMP－1含量極低，在各種刺激下可表達(dá)。加重黏膜組織損傷程度［20］。TGF－β是一種抑炎因子，可抑制促炎因子TNF－α、IFN－γ產(chǎn)生，在炎癥反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮重要作用［21］。本研究顯示，UC患者血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平均明顯高于對(duì)照組，IFN－β水平明顯低于對(duì)照組，且不同發(fā)病狀態(tài)UC患者之間存在明顯差異（P＜0.05），與既往的研究［22－23］一致，肯定了上述5種炎癥因子在UC發(fā)生、發(fā)展中的作用，提示炎癥因子水平表達(dá)變化可準(zhǔn)確反映UC患者的發(fā)病狀態(tài)。

受腸道菌群失調(diào)及腸黏膜炎癥反應(yīng)的影響，UC患者存在明顯腸道免疫功能異常。體液免疫是微創(chuàng)腸道菌群平衡的主要系統(tǒng)［24］。有學(xué)者證實(shí)，UC患者存在不同程度的體液免疫功能紊亂，血清免疫球蛋白IgA、IgM表達(dá)發(fā)生明顯變化［25－26］。本研究發(fā)現(xiàn)，UC患者血清IgA、IgM水平均明顯低于對(duì)照組，UC患者中急性組、慢性復(fù)發(fā)組、慢性持續(xù)組均依次降低升高（P＜0.05）。進(jìn)一步證實(shí)UC患者存在明顯的體液免疫功能紊亂，以IgA、IgM為主，IgG無(wú)明顯變化，且隨著病情加重而明顯降低，這與彭林艷等［27］的研究結(jié)果一致。本研究結(jié)果顯示，UC患者腸桿菌株數(shù)、腸球菌株數(shù)與血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與血清IFN－β水平呈正相關(guān)（P＜0.05）；血清IgA、IgM水平及雙歧桿菌株數(shù)、乳桿菌株數(shù)與血清MMP－1、TGF－β、HMGB1、sIL－2R 水平呈正相關(guān)（P＜0.05），與血清IFN－β水平呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。提示，UC患者的炎癥狀態(tài)與免疫球蛋白及腸道菌群變化密切相關(guān)，UC患者的機(jī)體高炎癥狀態(tài)會(huì)加重腸道菌群失衡及免疫球蛋白功能異常，形成炎癥因子釋放—腸道菌群失調(diào)—免疫功能異常的惡性循環(huán)，進(jìn)而不斷促進(jìn)疾病惡化。

綜上所述，不同發(fā)病狀態(tài)UC患者的免疫球蛋白及腸道菌群不同，且與機(jī)體炎癥狀態(tài)具有一定相關(guān)性，可作為判斷UC患者病情的重要參考指標(biāo)。